Funktionell avbildning av Viral transkription fabriker använder 3D fluorescensmikroskopi
Summary
Viral transkriptionell fabriker är diskreta strukturer som är berikad med cellulära RNA-polymeras II att öka viral gentranskription under reaktivering. Här beskrivs en metod för att hitta platser att aktivt transkribera viral kromatin i 3D kärn-rymden genom en kombination av immunofluorescens färgning och i situ RNA hybridisering.
Abstract
Det är väl känt att rumsliga och tidsmässiga regleringen av gener är en integrerad del av reglerar korrekt genuttryck. Därför är det ovärderligt att förstå var och när transkription sker inom kärnkraft utrymme och att visualisera förhållandet mellan episomes smittade inom samma cellens kärna. Här, både immunofluorescens (IFA) och RNA-fisk har varit combinedto identifiera aktivt transkribera Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) episomes. Genom färgning KSHV latens-associerade nukleär antigen (LANA), är det möjligt att lokalisera där viral episomes finns inom kärnan. Dessutom, genom att designa RNA-fisk sonder att rikta regionen intron i en viral genen, som uttrycks endast under produktiv infektion, kan begynnande RNA avskrifter finnas. Med denna kombination av molekylär sonder, är det möjligt att visualisera montering av stor viral transkription fabriker och analysera den rumsliga regleringen av viral genuttryck under KSHV reaktivering. Genom att inkludera anti-RNA-polymeras II antikroppen färgning, kan en också visualisera kopplingen mellan RNA-polymeras II (RNAPII) aggregering och KSHV transkription under reaktivering.
Introduction
Det har blivit allt tydligare att spatiotemporal organisationen av kärnan spelar en viktig roll i modulerande finstämda genuttryck i Eukaryoter. De flesta vävnad specifika gener är fördelade över många kromosomer och måste regleras synkront för att reagera på specifika stimuli på ett samordnat sätt1. Celler konstruera aktiva kromatin hubbar (ACH) som ett sätt att sammanföra gener och deras cis-reglerande komponenter till specifika nukleära utrymme1.
Det har också visats i olika studier att även om kärnan verkar mycket tät och trögflytande, biologiskt aktiva molekyler kan passera kärnan ganska snabbt via diffusion2. Till följd av detta tillfälliga boende hoppa de flesta DNA-bindande proteiner’ ‘ från bindande webbplats bindande webbplats, känna sig runt kärnkraft utrymmet, vilket möjliggör en mycket anpassningsbar och mångsidig nucleus2.
Trots detta dynamiska beteende av biomolekyler i kärnan, kärn organ utan membran som (men inte begränsat till) det nucleolus, Cajal organ och promyeloisk leukemi kärn organ (PML-NB) fortfarande existerar. Det är genom en mängd olika mekanismer såsom DNA tandemupprepningar (nucleolus), rRNA (nucleolus) och strukturella proteiner såsom coilin (Cajal förkroppsligar) eller PML proteiner (PML-NB) som håller dessa konstruktioner grupp3,4,5 . Dessa strukturer och andra församlingar såsom transkription fabriker fungera som ställningar som inte bara öka den lokala koncentrationen av nödvändiga komponenter, men också reglerar sammansättningen av proteiner och nukleinsyror inom dem att slutligen skapa en central plats för effektiv cellulära funktioner6.
Visualisera när och var nukleära kontostrukturer formuläret ger en mängd information för forskare som studerar epigenetik. Ur virologi reaktivering av latent infekterade virus, till exempel KSHV, betydligt förändrar landskapet av kärnan och distribution av nukleära enzymer att skifta transkription främst från cellulära gener till virala gener, slutligen till producera fullt fungerande viral avkomma7,8. Hur KSHV manipulera den cellulära gen uttryck maskinen att underlätta viral genuttryck? Sådan information kan också belysa temporal cellulära gen regleringsmekanismer.
Liksom alla andra herpesviruses har KSHV två livscykler som kallas lytisk replikering och latens. KSHV bor främst i latens scenen, där de flesta av dess viral genen uttryck är tystade, förutom latens associerade gener9,10. Under latens KSHV producerar tillhörande latens nukleär antigen (LANA), som konstitutivt binder virala arvsmassan och tjuder viral kromatin till kromosom11. På grund av LANAS intim relation med den virala arvsmassan är det möjligt att använda IFA och DAPI att fläcken och lokalisera var de virala episomes var i förhållande till värd kromatinet.
För att studera KSHV reaktivering på nivån enda episome och föreningen med andra virala episomes i en infekterad cell, har en strategi för att lokalisera aktivt transkribera viral kromatin i situ fastställts. Följaktligen LANA och RNAPII IFA med intron RNA-fisk kombinerades, genom att generera RNA-fisk prober som binder till regionen intron (exakta probe sekvenser kan hittas i Izumiya Labbets senaste publikation8) KSHV K-Rta-den viktiga virala protein som är nödvändig och tillräcklig för KSHV reaktivering-det var möjligt att identifiera där transkription faktiskt äger rum8,11,12,13,14,15 . Denna intron RNA-FISH teknik gör det möjligt för forskare att visualisera där mRNA är transkriberas omedelbart innan det skarvas och exporteras till cytoplasman16,17.
KSHV kan återaktiveras genom olika kemiska stimuli inklusive phorbol estrar såsom 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) och Histon histondeacetylas-hämmare såsom natrium butyrate, dessutom KSHV kan förmås att återaktivera av överuttryck av den virala transkriptionsfaktor, K-Rta19. Forskare har framgångsrikt ökat effektiviteten i KSHV reaktivering genom att synkronisera cellens cykler innan inducerande reaktivering18. Således, för dessa särskilt undersökningar, celler synkroniserades med en dubbel tymidin block (protokollet beskrivs nedan) och inkuberas med TPA och doxycyklin (Dox) för en kort tid. Doxycycline användes eftersom den cellinje som utnyttjas i dessa experiment har en doxycyklin-inducerbara K-Rta kassett, som klonats från cDNA och inkluderar inte regionen intron i K-Rta. Även om det är möjligt att återaktivera KSHV använder endast inducerad K-Rta uttryck, det har bevisats av andra forskare att K-Rta uttryck enbart på grund av en mängd olika biokemiska faktorer visar sig vara en svag reaktivering stimuli20. Genom att kombinera alla dessa, och genom att begränsa de drogen inkubationer till en kort tidsperiod, uppnåddes en robust men inte alltför konstgjorda KSHV reaktivering för avbildning.
Efter märkning LANA, RNAPII, K-Rta introner, och DNA som beskrivs i detta papper, 3D fluorescens imaging utfördes med widefield deconvolution Mikroskop. Efter bearbetning med bildbehandlingsprogram, kan den rumsliga fördelningen av aktiv viral episomes utvärderas ordentligt. Med denna teknik, kan de centrala frågorna angående den grundläggande karaktären av bildandet av aktiva kromatin hubbar och andra nukleära strukturer studeras. Att ha identiska viral episomes i en enda cell som bearbetar samma rättsliga element kan representera en unik forskningsverktyg för att fördjupa förståelsen av spatiotemporal gen regleringsmekanismer.
En begränsning av imaging flera cell exemplar fast vid olika tidpunkter för att karakterisera en inneboende molekylär dynamik är att subtila eller småskaliga förändringar i fluorescens fördelningen oupptäckta eller anses obetydlig. Detta gäller såvida i sällsynta fall, varje cell observeras visar samma subtil förändring. Således, full spatiotemporal förhållandet mellan aktiv viral transkription och andra nukleära strukturer inte kritiskt utvärderas med hjälp av fasta imaging. För att lösa dessa tekniska utmaningar, är det bästa sättet att följa platsen för viktiga cellulära enzymer över tid och bild levande celler som har präglat viral episomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns vissa aspekter av det protokoll som kan ändras för att rymma ovanliga omständigheter. Valet av fixering och permeabilisering buffertar kan också ändras. För fixering buffertar, paraformaldehyd är också effektivt och etanol kan användas för permeabilisering.
Snabbkylning formaldehyd med glycin PBS rekommenderas eftersom det förhindrar formaldehyd inaktivera antikropparna i avsaknad av bovint serumalbumin (BSA), men om coverslips tvättas grundligt tillräckligt, det glycin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health grant (R01-DE025985) och en American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Detta arbete stöddes också av bidrag från US Department of Agriculture (2015-67015-23268 och 2014-67015-21787) och nya initiativ forskningsanslag från University of California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
