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발생학

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

Published: January 28, 2018
doi:
10.3791/56835
, , , , , , , ,
1Grupo de Acuicultura y Biodiversidad, Instituto de Ciencia y Tecnología Animal,Universitat Politècnica de València, 2Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety,Szent Istvan University

Summary

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

지난 년 동안 여러 연구 그룹 개발 및 유럽 장 어 처리 및 성숙에 대 한 새로운 프로토콜의 개선에 노력 하고있다. 로 서 아직, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사 치료, 몇 주 동안 높은-품질의 높은 볼륨 생산의 단지 5-6 주 후 남성 maturate를 입증 해야 합니다. 또한, 정자 cryopreservation 프로토콜 다른 extender를 사용 하 여, cryoprotectants 및 냉각 시간을 녹고 있다 이전 설명 유럽 장 어에 대 한. 여기, 우리가 보여줍니다 수정 또는 cryopreservation, Tanaka´s 익스텐더 솔루션 직접 사용 될 수 있다 솔루션 및 희석의 다른 종류의 사용을 불필요 한 만들기. 또한, 메탄올의 사용은 cryoprotectant로 만드는이 프로토콜 사용 하기 쉬운 메탄올은 낮은 독성과 정자를 활성화 하지 않습니다. 정자는 cryoprotectant 추가 직후 cryopreserved 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 오래 되 고 해 동 후 사용할 수 있습니다. 또한, 정자 운동 성은 비록 그것이 신선한 정자 보다 낮은 녹고 후 여전히 높다입니다. 이 작품의 목표 처리, 성숙 및 정자 cryopreservation 유럽 장 어에 대 한 가장 사용할 수 있는 프로토콜을 표시 하는 것입니다.

Introduction

지난 25 년 동안 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 유럽 해 안에 도착의 수는 꾸준히 90 1,2,3감소. 오염, 감염, overfishing, 서식 지 파괴 등이 급격 한 하락을 설명 하는 몇 가지 요인이 있다. 이 모든 중요 한 멸종 위기 4자연 보존 (IUCN) 목록은 국제 연합에 유럽 장 어의 포함에 지도 하는이 종에 깊은 영향을 했다. 따라서, 기술 및 포로에 복제에 대 한 프로토콜의 개발은 필요 합니다.

포로에서 유럽 장 어의 성숙 호르몬 치료 5,,67 에 의해 이루어집니다 하지만 남녀 모두에서 gametes의 생산 8동기화 할 어렵습니다. 새로운 안 드로 겐 임 플 란 트의 개발 oogenesis 뱀장어 9,에 있는 가속을 보이고 있다 하더라도10, 여성에서 마지막 성숙의 타이밍은 여전히 매우 변수 하 고 11를 제어 하기 어려운. 따라서, 기술의 정자 12,,1314 및 cryopreservation 단기 저장 복제 관리, 생식 체 동기화 불필요 한 8를 만들기 위해 필요 하다.

유럽 장 어 정자의 cryopreservation 2003 15,16이후 개발 되었습니다. 몇몇 연구원은 성공적인 프로토콜 cryoprotectants 16,17,18,,1920디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 또는 메탄올을 사용 하 여 설계 되었습니다. 두 프로토콜 성공적으로 사용 되었습니다, 하지만 해 동된 정자 DMSO와 cryopreserved의 얻은 세포 생존 능력에 메탄올 20,21보다 낮은 것입니다. 또한, 장 정자 DMSO와 접촉을 활성화 하 고 더 지루한 정자 조작 19필요 하, 그러므로 메탄올 DMSO 보다 유럽 장 어 정자에 대 한 더 적합 한 cryoprotectant 이다.

여기, 아래 최적의 처리 및 유럽 장 어의 호르몬 치료에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이것 이외에,이 종에서 정자 품질 평가 대 한 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 최고의 유럽 장 어 정자 cryopreservation 프로토콜도 설명 됩니다.

Protocol

이 프로토콜에서 설명 하는 유럽 장 어와 함께 작업 하기 위한 모든 절차는 위원회의 윤리의 동물 실험 Universitat Politècnica de València, 스페인 법률 및 규정 제어 실험에 의해 승인 및 살아있는 동물에 절차입니다. 1. 물고기 유지 보수 연구 시설에 유럽 뱀장어를 가져오고 재순환 시스템 200 L 수족관에 넣어. 20 ° C에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 온도 쿨러를 사용 합니?…

Representative Results

70% 이상, 정자 운동 성 가진 18 뱀장어에서 정자는이 연구에 대 한 선정 됐다. 결과 신선한 정자 (표 1 및 그림 2)에서 그에 비해 녹고 후 모든 품질 매개 변수에서 감소를 보였다. 운동 성 결과 (± S.E.M., 의미 n = 18) 총 운동 성 및 진보적인 운동 후 해 동 정자 샘플에서 발견 보다 신선한 정자에 더 높은 총 운동 성 및 진보적인 운동 성을 보였…

Discussion

이 프로토콜 유럽 장 어 성숙, 처리 및 정자 cryopreservation에 대 한 완전 한 프로세스를 설명합니다. 여기에 설명 된 농업 조건 빠른 성숙 및이 종 6,,725에 높은-품질의 높은 볼륨의 생산을 위한 최적의 있습니다. 이 cryopreservation 프로토콜 및 해빙 후 수정에 대 한 그것의 잠재적인 사용의 성공 신선한 정자 26의 품…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 게시는 유럽 연합의 수평선 2020 연구에 의해 투자 되었다 및 혁신 프로그램 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 없음 642893 (감동), 비용 사무실 (비용 액션 FA 1205, AQUAGAMETE), 그리고 우수 연구 센터- 1476-4/2016/FEKUT입니다.

Materials

AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick
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References

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European EelAnguilla AnguillaHormonal MaturationSperm CryopreservationHCG InjectionsTanaka’s ExtenderMethanol CryoprotectantSperm Motility

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).
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