Summary

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Published: March 08, 2018
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Summary

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.

Abstract

Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.

Introduction

Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die “Schatztruhe”9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgeleitet DNA PCR-basierten Projekten, oft verwies Forscher mittels nur Marker gefunden in hohe Kopie, wie Regionen von Chloroplast Genom oder die interne transkribierten Distanzstück (ITS) aus der ribosomalen behindert. RNA. Qualität der Proben und DNA variieren ausgiebig basierend auf Methoden der Konservierung9,10, mit Doppelstrang-Brüche und Fragmentierung von Wärme in der Trocknung werden die häufigsten Formen von Schäden, die Schaffung der so genannte 90 % DNA Überbrückungskupplung, die PCR-basierten Studien11belastet hat. Abgesehen von Fragmentierung ist das zweithäufigste Problem im Herbarium Genomics Verunreinigungen, wie z. B. die endophytische Pilze13 abgeleitet oder Pilze Obduktion erworben nach Sammlung aber vor dem Einbau in das Herbarium12, obwohl dieses Problem kann gelöst Bioinformatically rechts Pilze Datenbank (s.u.) gegeben werden. Eine dritte, und weniger üblich, Problem ist Sequenz Modifikation durch Cytosin Deamination (C/G→T/A)14, obwohl es wird geschätzt (~ 0,03 %) niedrig sein Herbarium Exemplare11. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) kann das Problem der Fragmentierung mit kurzen Lese- und Sequenzierung Tiefe12,15, so dass Genomebene Datenerfassung aus zahlreichen Proben mit niedriger Qualität überwunden werden DNA, und manchmal sogar ganze Genom-Sequenzierung15erlaubt.

Herbarium Proben werden immer häufiger verwendet und sind ein größerer Bestandteil der phylogenetische Projekte16. Eine aktuelle Herausforderung für HTS Herbar zu verwenden ist konsequent ausreichend Doppel stranded DNA, eine notwendige Voraussetzung für die Sequenzierung Protokolle, von zahlreichen Tierarten in einer fristgerechten Weise erhalten ohne Methoden zur individuellen Optimierung Proben. In diesem Papier wird ein Protokoll für die DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung der Herbarbelege demonstriert, nutzt die vorhandenen Methoden und ändert sie, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht für die Komplettbearbeitung von Probe zu einer Bibliothek von 24 Proben in 13 h, mit Hands-on-Zeit 8 h oder 16 h, mit 9 h Arbeitsaufwand beträgt, wenn der optionale Reamplification-Schritt benötigt wird. Gleichzeitige Verarbeitung von mehr Proben ist erreichbar, wenn der limitierende Faktor Zentrifuge Kapazität und technisches Geschick. Das Protokoll soll nur typische Laborgeräte (Thermocycler, Zentrifuge und magnetische steht) anstelle von Spezialausrüstung, wie z. B. einen Vernebler oder Sonikator, für Scheren DNA benötigen.

DNA-Qualität, Fragmentgröße und Menge sind Faktoren für den Einsatz von Herbar im Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimente begrenzt. Weitere Methoden zum Herbarium DNA zu isolieren und Erstellen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken haben gezeigt, das Dienstprogramm zu verwenden so wenig wie 10 ng DNA-16; jedoch bedürfen experimentell ermitteln die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dies wird unpraktisch, beim Umgang mit äußerst geringen Mengen an lebensfähigen Doppel DNA (DsDNA), gestrandet, da einige Herbar nur genügend DNA für eine einzelne Bibliothek Zubereitung produzieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine einzelne Zahl der Zyklen unabhängig von Sample-Qualität, so dass keine DNA Bibliothek Optimierungsschritte verloren geht. Stattdessen wird ein Reamplification Schritt aufgerufen, wenn Bibliotheken nicht die Mindestbeträge für die Sequenzierung erforderlich erfüllen. Viele Herbarium Proben sind selten und besitzen wenig Material macht es schwierig, destruktive Probenahme in vielen Fällen zu rechtfertigen. Um dem entgegenzuwirken, die vorgestellte Protokoll ermöglicht DsDNA Eingang Größen von weniger als 1,25 ng in der Bibliothek Vorbereitungsprozess, Erweiterung des lebensfähigen Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Notwendigkeit einer destruktiven Entnahme von Proben zu minimieren.

Das folgende Protokoll wurde optimiert für Gräser und getestet auf Hunderte verschiedener Arten von Herbarium Proben, obwohl wir erwarten, dass das Protokoll auf viele andere Pflanzengruppen angewendet werden kann. Freuen Sie sich auf eine optionale Wiederherstellungsschritt, die verwendet werden, um niedrige Qualität und/oder seltene Exemplare zu speichern. Basierend auf mehr als zweihundert Herbar getestet, funktioniert dieses Protokoll auf Proben mit niedrigen Gewebe ein- und Qualität, so dass für die Erhaltung der seltene Exemplare durch minimale destruktive Probenahme. Hier wird gezeigt, dass dieses Protokoll hochwertige Bibliotheken bieten kann, die für Datenqualität-basierte Projekte sequenziert werden können.

Protocol

1. vor dem Start Machen frische Cetyl Trimethylammonium-Bromid (CTAB) Puffer17 durch Zugabe von 20 g CTAB, 10 g von Polyvinylpyrrolidon (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 5 M NaCl und 400,0 mL Reagenz Wasser zusammen, und das Gesamtvolumen zu 1 L per Reagenz-Grade Wasser bringen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0.Hinweis: Zusätzliche Reagenzien können CTAB je nach sekundären Verbindungen in einzelnen Taxa hinzuge…

Representative Results

DNA-Isolierung und endgültige Bibliothek ErtragIn dieser Studie wurde die Wirksamkeit des Protokolls für die Isolierung von Herbarium DNA und die Verwertung von hochwertigen Sequenzierung Bibliotheken nachgewiesen mit fünfzig verschiedenen Proben mit das älteste aus dem Jahre 1920 und der jüngste ab 2012 (Tabelle 2). Für jede Probe wurde etwa 10 mg Blattgewebe für DNA-Isolierung verwendet. Grüner Blattgewebe wurde bevorzugt, falls verfügbar, …

Discussion

Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch w…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).

Materials

Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4452300 96 well 
Gel Imaging System Azure Biosystems c300
Microfuge 20 Series Beckman Coulter B30137
Digital Dry Bath Benchmark Scientific BSH1001
Electrophoresis System EasyCast B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) ELGA  89204-092
DNA LoBind Tube  Eppendorf 30108078 2 ml
Mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific 12-812
Mortar Fisher Scientific S02591 porcelain
Pestle fisher Scientific S02595 porcelain
Centrifuge tubes fisher Scientific 21-403-161
Microwave Kenmore 405.7309231
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR VWR 20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Balance Mettler Toledo PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage Nalgene F9401
Magnetic-Ring Stand  ThermoFisher Scientific  AM10050 96 well 
Water Bath VWR 89032-210
Hot Plate Stirrers VWR 97042-754
Liquid Nitrogen Airgas UN1977
1 X TE Buffer Ambion AM9849 pH 8.0
CTAB AMRESCO 0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL AMRESCO 0482-200ML
Ribonuclease A AMRESCO E866-5ML 10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63882
Sodium Chloride bio WORLD 705744
Isopropyl Alcohol bio WORLD 40970004-1
Nuclease Free water bio WORLD 42300012-2
Isoamyl Alcohol Fisher Scientific A393-500
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific s608-500
LE Agarose GeneMate E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder Gold Biotechnology D003-500
EDTA, Disodium Salt IBI Scientific IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32854
TRIS MP Biomedicals 103133 ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X) New England BioLabs B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase New England BioLabs M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina  New England BioLabs E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabs E7600S Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus Omega bio-tek M1386-02
GelRed 10000 X Pheonix Research 41003-1
Phenol solution SIGMA Life Science P4557-400ml
PVP40 SIGMA-Aldrich PVP40-50G
Chloroform VWR EM8.22265.2500
Ethanol Koptec V1016 200 Proof
Silica sand VWR 14808-60-7
Reamplification primers Integrated DNA Technologies see text
Sequencher v.5.0.1 GeneCodes

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Cite This Article
Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg, E. A. Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens. J. Vis. Exp. (133), e56837, doi:10.3791/56837 (2018).

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