Summary

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Published: March 08, 2018
doi:

Summary

Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.

Abstract

Herbarios son una fuente valiosa de material vegetal que se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos. El uso de especímenes de herbario está asociado con un número de desafíos, incluyendo calidad de preservación de la muestra ADN degradado y muestreo destructivo de especímenes raros. Para utilizar más eficazmente material de herbario en proyectos grandes de la secuencia, es necesario un método confiable y escalable de ADN aislamiento y biblioteca de preparación. Este documento muestra un protocolo robusto, de principio a fin para ADN aislamiento y alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario que requieren modificación para muestras individuales. Este protocolo se adapta para baja calidad secado planta material y toma ventaja de los métodos existentes mediante la optimización de tejido pulido, modificar la selección de tamaño de la biblioteca y presentando un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento. Reamplificación de bibliotecas de ADN de bajo rendimiento puede rescatar muestras derivadas de especímenes de herbario insustituible y potencialmente valiosa, negando la necesidad de muestreo destructivo adicional y sin introducir sesgo de secuencia perceptible común aplicaciones filogenéticas. El protocolo ha sido probado en cientos de especies de gramíneas, pero se espera que sea adaptable para el uso en otros linajes de la planta después de la verificación. Este protocolo puede ser limitada por ADN muy degradado, donde fragmentos no existen en la gama del tamaño deseado, y por metabolitos secundarios presentes en un material de planta que inhiben el aislamiento de ADN limpio. En general, este protocolo presenta un método rápido y completo que permite la extracción de ADN y preparación de la biblioteca de 24 muestras en menos de 13 horas, con solo 8 h de tiempo práctica activa con modificaciones mínimas.

Introduction

Colecciones de herbario son una fuente potencialmente valiosa de especies y diversidad genómica de estudios incluyendo phylogenetics1,2,3, genética de poblaciones4,5, conservación Biología6, de la biología de las especies invasoras7y rasgo evolución8. La capacidad para obtener una rica diversidad de especies, poblaciones, regiones geográficas y momentos destaca el “tesoro”9 que es el herbario. Históricamente, la naturaleza degradada del ADN derivado de herbario ha obstaculizado los proyectos basados en PCR, a menudo relegando los investigadores a usar sólo los marcadores encontrados en copia alta, como las regiones del genoma de cloroplasto o el espaciador transcrito interno (ITS) de la ribosomal ARN. Calidad de las muestras y ADN varían ampliamente en base a métodos de conservación9,10, con las roturas de doble hebra y fragmentación de calor utilizado en el proceso de secado siendo las formas más comunes de daños, la creación de la supuesto 90% ADN calabozo que ha gravado estudios basados en PCR11. Aparte de fragmentación, lo segundo más frecuente en la genómica de herbario es contaminación, tales como que derivado de los hongos endófitos13 u hongos adquirieron post mortem después de la recolección, pero antes de montar en el herbario12, aunque este problema puede ser solucionado bioinformatically dado la derecha fungicida base de datos (véase abajo). Un problema terceros y menos común, es modificación de la secuencia a través de citosina desaminación (G→T/C/A)14, aunque se estima que bajo (~ 0,03%) en ejemplares de herbario11. Con el advenimiento de secuenciación de alto rendimiento (HTS), la cuestión de la fragmentación puede superarse con lecturas cortas y secuenciación profundidad12,15, permitiendo la adquisición de datos de nivel genómico de numerosas muestras con baja calidad ADN e incluso a veces permitiendo que todo el genoma secuencia15.

Muestras de herbario son cada vez más frecuente y son un componente más grande de proyectos filogenética16. Un reto actual de la utilización de especímenes de herbario para HTS constantemente es obtener suficiente ADN de trenzado doble, un requisito previo necesario para los protocolos de la secuencia, de numerosas especies de manera oportuna, sin necesidad de optimizar los métodos para el individuo muestras. En este documento, un protocolo para la extracción de ADN y biblioteca preparación de especímenes de herbario se demuestra que se aprovecha de los métodos existentes y modifica para permitir resultados rápidos y reproducibles. Este método permite el completo procesamiento del espécimen a una biblioteca de 24 muestras 13 h, con el tiempo práctico 8 h o 16 h, con tiempo práctica 9 h, cuando se requiere el paso de Reamplificación opcional. Proceso simultáneo de muestras más es factible, aunque el factor limitante es la centrifugadora de la capacidad y habilidad técnica. El protocolo está diseñado para requerir sólo típico equipo de laboratorio (termociclador, centrífuga y soportes magnéticos) en lugar de equipo especializado, como un nebulizador o un sonicador, para el corte de ADN.

Calidad de ADN, el tamaño de fragmento y cantidad son limitantes para el uso de ejemplares de herbario en experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Otros métodos para aislar ADN de herbario y crear bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento han demostrado la utilidad de utilizar tan poco como 10 ng de ADN16; sin embargo necesitan determinar experimentalmente el número óptimo de PCR ciclos necesarios para la preparación de la biblioteca. Esto se hace impracticable cuando tratar con muy pequeñas cantidades de viable doble trenzado DNA (dsDNA), como algunos ejemplares de herbario producen sólo suficiente ADN para la preparación de una sola biblioteca. El método presentado aquí utiliza un número de ciclos independientemente de la calidad de la muestra, por lo que no hay ADN se pierde en los pasos de optimización biblioteca. En cambio, un paso de Reamplificación se invoca cuando las bibliotecas no cumplen con los montos mínimos necesarios para la secuencia. Muchas muestras de herbario son raras y poseen poco material, lo que hace difícil justificar muestreo destructivo en muchos casos. Para contrarrestar esto, el protocolo presentado permite dsDNA entrada tamaños menos de 1.25 ng en el proceso de preparación de la biblioteca, ampliando el alcance de las muestras viables de alto rendimiento de secuenciación y minimizando la necesidad de muestreo destructivo de muestras.

El siguiente protocolo ha sido optimizado para las hierbas y probado en cientos de diferentes especies de muestras de herbario, aunque esperamos que el protocolo se puede aplicar a muchos otros grupos de plantas. Incluye un paso de recuperación opcional que puede utilizarse para salvar a baja calidad o especímenes raros. Basado en más de 200 especímenes de herbario probados, este protocolo trabaja en especímenes con entrada baja de tejido y calidad, lo que permite la preservación de especímenes raros a través de un mínimo muestreo destructivo. Aquí se demuestra que este protocolo puede proporcionar bibliotecas de alta calidad que pueden ser secuenciadas para proyectos basados en la filogenómica.

Protocol

1. antes de que arranque Hacer fresco cetil trimetilamonio bromuro (CTAB) buffer17 añadiendo 20 g de CTAB, 10 g de polivinilpirrolidona (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL de 0,5 M etilendiaminotetracético pH ácido (EDTA) 8.0, 280,0 mL de 5 M de NaCl y 400,0 mL agua de reactivo juntos y llevar el volumen a 1 L con grado de reactivo agua. Ajustar el pH a 8.0.Nota: Reactivos adicionales pueden agregarse a CTAB dependiendo de compuestos secundarios de taxa individuales. Ver All…

Representative Results

Aislamiento de ADN y rendimiento Final de la bibliotecaEn este estudio, se demostró la eficacia del protocolo para el aislamiento de la DNA del herbario y la recuperación de las bibliotecas de la secuencia de alta calidad con cincuenta muestras diferentes la más antigua de 1920 y el más joven de 2012 (tabla 2). Para cada muestra, se utilizó aproximadamente 10 mg de tejido foliar para el aislamiento de ADN. Tejido foliar más verde se vio favoreci…

Discussion

El protocolo presentado aquí es un método integral y robusto para aislamiento de DNA y la secuencia de preparación de biblioteca de muestras de la planta seca. La consistencia del método y mínima necesidad de alterarlo según el ejemplar calidad hacen que escalable para proyectos grandes secuenciación basada en herbario. La inclusión de un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento permite la inclusión de baja calidad, baja cantidad, rara o históricamente importantes muestras qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Taylor AuBuchon-anciano, Jordania Teisher y Kristina Zudock asistencia en ejemplares de herbario de muestreo y el jardín botánico de Missouri para el acceso a los especímenes de herbario para muestreo destructivo. Este trabajo fue el apoyo de una beca de la National Science Foundation (DEB-1457748).

Materials

Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4452300 96 well 
Gel Imaging System Azure Biosystems c300
Microfuge 20 Series Beckman Coulter B30137
Digital Dry Bath Benchmark Scientific BSH1001
Electrophoresis System EasyCast B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) ELGA  89204-092
DNA LoBind Tube  Eppendorf 30108078 2 ml
Mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific 12-812
Mortar Fisher Scientific S02591 porcelain
Pestle fisher Scientific S02595 porcelain
Centrifuge tubes fisher Scientific 21-403-161
Microwave Kenmore 405.7309231
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR VWR 20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Balance Mettler Toledo PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage Nalgene F9401
Magnetic-Ring Stand  ThermoFisher Scientific  AM10050 96 well 
Water Bath VWR 89032-210
Hot Plate Stirrers VWR 97042-754
Liquid Nitrogen Airgas UN1977
1 X TE Buffer Ambion AM9849 pH 8.0
CTAB AMRESCO 0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL AMRESCO 0482-200ML
Ribonuclease A AMRESCO E866-5ML 10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63882
Sodium Chloride bio WORLD 705744
Isopropyl Alcohol bio WORLD 40970004-1
Nuclease Free water bio WORLD 42300012-2
Isoamyl Alcohol Fisher Scientific A393-500
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific s608-500
LE Agarose GeneMate E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder Gold Biotechnology D003-500
EDTA, Disodium Salt IBI Scientific IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32854
TRIS MP Biomedicals 103133 ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X) New England BioLabs B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase New England BioLabs M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina  New England BioLabs E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabs E7600S Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus Omega bio-tek M1386-02
GelRed 10000 X Pheonix Research 41003-1
Phenol solution SIGMA Life Science P4557-400ml
PVP40 SIGMA-Aldrich PVP40-50G
Chloroform VWR EM8.22265.2500
Ethanol Koptec V1016 200 Proof
Silica sand VWR 14808-60-7
Reamplification primers Integrated DNA Technologies see text
Sequencher v.5.0.1 GeneCodes

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Cite This Article
Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg, E. A. Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens. J. Vis. Exp. (133), e56837, doi:10.3791/56837 (2018).

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