Dialyse : Séparation basée sur la diffusion
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개요
Dialyse est une technique courante utilisée en biochimie pour séparer des molécules basées sur la diffusion. Dans cette procédure, une membrane semiperméable permet le mouvement de certaines molécules selon la taille. Cette méthode peut être appliquée à l’enlèvement de tampon, appelée dessalage, ou échange tampon molécules ou d’ions d’une solution protéique.
Cette vidéo couvre les principes de la dialyse ainsi qu’une procédure générale. plusieurs demandes de dialyse sont examinées, y compris la suppression des réactifs dégradés après ultracentrifugation, la suppression de détergent après une protéine de la membrane d’extraction et de la reconstitution des protéines en modifiant l’environnement de la solution.
échantillons biochimiques ont généralement des concentrations de tampon haute qui peuvent perturber le traitement en aval et l’analyse. Dialyse est une technique commune, peu coûteuse, utilisée pour séparer les molécules basées sur la diffusion. La méthode utilise une membrane semi-perméable qui permet la circulation de certains composants, selon la taille. Cette vidéo va expliquer les concepts de dialyse, une procédure générale et certaines de ses utilisations en biochimie.
l’aspect le plus important de la dialyse est une membrane semi-perméable, qui a des pores qui imposent un seuil de poids moléculaire, permettant aux molécules au-dessous d’une certaine taille de passer à travers. Par exemple, une membrane k 10 conservera généralement des molécules plus grands que 10 kilodaltons. Toutefois, le seuil de poids moléculaire n’est pas une frontière discrète ou précise. La membrane contient généralement une large gamme de tailles de pores, donc une petite fraction des molécules proches du seuil peut être perdue.
Depuis le seuil de poids moléculaire est défini à l’aide de protéines globulaires, des molécules linéaires de même masse, comme l’ADN ou d’ARN, peut passer à travers. Les membranes sont généralement choisies une moitié à un tiers le poids moléculaire de la molécule désirée.
Pour exécuter la procédure, un échantillon est placé dans la membrane, qui est ensuite ajoutée à un grand volume de solution, appelée le dialysat. Au fil du temps, des molécules plus petites seront diffuser librement à travers la membrane entre l’échantillon et le dialysat, tandis que les plus grande et biomolécules sont détenues au sein. Dialyse est un processus lent. Il est commun pour lui permettre d’exécuter toute la nuit, ou même sur plusieurs jours.
Si le dialysat est l’eau pure, diminue la concentration globale de la mémoire tampon, un processus appelé dessalage. Si la solution contient des autres petites particules, certains seront déplaceront dans l’échantillon, conduisant à l’échange de la mémoire tampon. Parce que la dialyse est un processus d’équilibre, le dialysat peut être actualisé plusieurs fois à déplacer de plus petites molécules. Une fois le processus terminé l’échantillon est re-recueilli aux fins de traitement ultérieur.
Maintenant que vous avez ' ai vu les rudiments de la dialyse, laissez ' s jetez un oeil à un mode opératoire général.
avant de commencer la procédure, la membrane est préalablement trempée dans le dialysat. Cela rend plus facile à utiliser et supprime tous les préservatifs. Une fois prêt, l’échantillon est recueillie, généralement avec une seringue et est ensuite ajouté au conteneur de dialyse. Ceci peut être nu tube, ou contenue dans une cassette. Excès d’air est supprimée de la configuration de dialyse à maximiser l’échantillon ' superficie s avec la membrane. Le programme d’installation est ensuite placé dans le dialysat avec agitateurs pour maximiser la diffusion. Elle doit flotter pour n’inhiber pas brasser.
Le dialysat est renouvelé à des intervalles pertinents comme l’équilibre entre l’échantillon et le dialysat est atteint. Après la dernière modification, la réaction est généralement laissée pour exécuter toute la nuit. Après une période suffisamment longue, l’échantillon sans tampon ou – échangée est supprimée de la cassette. Une fois collectés, l’échantillon peut être analysé ou traitée ultérieurement, selon la nature de l’expérience.
maintenant que nous ' ve regardé une procédure générale de dialyse, laissez ' s voir quelques-unes des façons cette technique est utilisée en biochimie.
Gradients de densité desont un moyen courant pour séparer les échantillons biologiques complexes. Ce concept repose sur la distribution en petites particules, typiquement saccharose ou césium ions chlorure. Une fois terminé, ces réactifs doivent généralement être retiré avant l’échantillon prélevé peut être traitée. Dialyse permet d’utiliser l’échantillon purifié pour l’analyse future.
Certaines protéines sont présentes dans une cellule ' bicouche lipidique s et sont généralement étudiés par eux entremêlant dans des vésicules lipidiques sphériques appelées liposomes. Les protéines et les lipides sont d’abord extraites avec un détergent. Dialyse peut être utilisé pour retirer lentement le détergent, formant protéoliposomes.
Après purification, certaines protéines sont misfolded, ou dénaturés, conduisant à une perte de fonctionnalité. Les composés qui causent ces changements dans la structure peuvent être enlevés avec la dialyse, conduisant à la réforme du fonctionnement des analytes.
vous ' ve juste regardé JoVE ' s-vidéo sur la dialyse. Vous devez maintenant comprendre cette méthode axée sur la diffusion et l’utilisation de cette technique une simple procédure expérimentale.
Merci pour regarder !
Procedure
Disclosures
내레이션 대본
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
