Berigelse af bakteriel lipoproteiner og forberedelse af N-terminale Lipopeptides for Strukturbestemmelse af massespektrometri
Summary
Berigelse af bakteriel lipoproteiner ved hjælp af en nonionisk overfladeaktivt stof fase partitionering metode er beskrevet til direkte brug i TLR assays eller andre programmer. Yderligere skridt er detaljeret at forberede N-terminale tryptic lipopeptides for strukturel karakterisering af massespektrometri.
Abstract
Lipoproteiner er vigtige bestanddele af bakteriel celle kuvert og potent aktivatorer af pattedyr medfødte immunrespons. Trods deres betydning for både celle fysiologi og Immunologi, er stadig meget at blive opdaget omkring roman lipoprotein former, hvor de er syntetiseret, og effekten af de forskellige former på vært immunitet. Hvis du vil aktivere grundige undersøgelser af lipoproteiner, denne protokol beskriver en metode for bakteriel lipoprotein berigelse og forberedelse af N-terminale tryptic lipopeptides for Strukturbestemmelse af matrix assisted laser desorption ionisering-tid af en flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS). Udvide en etableret Triton X-114 fase partitionering metode for lipoprotein udvinding og berigelse af den bakterielle cellemembranen, protokollen indeholder yderligere trin for at fjerne ikke-lipoprotein forureninger, øge lipoprotein udbytte og renhed. Da lipoproteiner er almindeligt anvendt i Toll-lignende receptor (TLR) assays, det er afgørende at først karakterisere den N-terminale struktur af MALDI-TOF MS. Herein, en metode er præsenteret for at isolere koncentrerede hydrofobiske peptider beriget med N-terminalen lipopeptides egnet til direkte analyse af MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner, der har været adskilt af Sodium Dodecyl sulfat Poly-acrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) overføres til en nitrocellulose membran, fordøjet i situ med Trypsin, vaskes sekventielt for at fjerne polære tryptic peptider, og endelig elueret med chloroform-methanol. Når kombineret med MS i de mere polære trypsinized peptider fra vask løsninger, giver denne metode mulighed for at identificere lipoprotein såvel karakterisere sin N-terminus i et enkelt eksperiment. Forsætlig natrium addukt dannelse kan også anvendes som et redskab til at fremme mere strukturelt informative fragmentering spektre. I sidste ende, berigelse af lipoproteiner og bestemmelse af deres N-terminale strukturer vil muliggøre mere omfattende undersøgelser på denne allestedsnærværende klasse af bakterielle proteiner.
Introduction
Bakteriel lipoproteiner er karakteriseret ved en bevaret N-terminale lipid-modificerede cystein, der forankrer kugleformede protein-domæne til celle membranen overflade. De er universelt fordelt i bakterier, der udgør 2-5% af alle cellulære gener i en typisk genom1. Lipoproteiner spiller en kritisk rolle i en bred vifte af cellulære processer, herunder næringsstof optagelse, signaltransduktion, samling af proteinkomplekser, og opretholde cellens kuvert strukturelle integritet2. I patogene bakterier tjene lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infektion tilskynder anerkendelse af N-terminale lipopeptides af Toll-lignende receptor (TLR) 2 en medfødte immunrespons fjerne invaderende patogener. Afhængigt af den N-terminale acylation stat, er lipoproteiner generelt anerkendt af alternative TLR2 heterodimerisk komplekser. TLR2-TLR1 genkender N-acylated lipopeptides, mens TLR2-TLR6 bindes gratis lipopeptid α-aminosyrer termini. En gang bundet, konvergerer signaling forløbene for at fremkalde sekretion af proinflammatoriske cytokiner3,4.
Man mente tidligere, at lipoprotein fra Gram-positive bakterier var diacylated og dem fra Gram-negative bakterier blev triacylated, kun ved fravær eller tilstedeværelse af et AMID-linked fedtsyre på den bevarede N-terminale cystein rest. Denne antagelse blev understøttet af manglen sekvens orthologs i Gram-positive genomer til Lnt, Gram-negative N-acyl-transferase, der danner triacylated lipoproteiner5. Men nyere undersøgelser har afsløret lipoprotein triacylation i Gram-positive Firmicutes at manglende lnt, samt tre nye N-terminale lipoprotein strukturer, betegnes peptidyl, lyso og N –acetyl former6,7 ,8. Disse resultater rejse spørgsmål om muligt endnu-til-være-opdagede lipoprotein former, sammen med grundlæggende spørgsmål om, hvordan disse nye lipoproteiner er lavet og hvilke fysiologiske formål eller fordel forskellige former give. Desuden, de klart viser genomforskning nuværende evne til at forudsige lipoprotein struktur. Ja, vi for nylig identificeret en roman klasse af lipoprotein N-acyl transferaser, kaldet Lit, fra Enterococcus faecalis og Bacillus cereus der gør lyso-form lipoproteiner9. Dette viser, at eksperimentelt kontrollere lipoprotein struktur, som kan blive udfordrende på grund af deres ekstremt hydrofob karakter og begrænsede metoder for at karakterisere deres molekylære struktur.
For at lette undersøgelser af lipoprotein induktion af vært immunrespons, samt N-terminale Strukturbestemmelse, har vi tilpasset flere tidligere beskrevet protokoller for at rense bakteriel lipoproteiner og forberede den N-terminale tryptic lipopeptides til analyse af MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner er beriget ved hjælp en etablerede Triton X-114 (herefter benævnt overfladeaktivt stof eller TX-114) fase partitionering metode, med optimering til at fjerne forurenende ikke-lipoproteiner og øge lipoprotein udbytte. Disse lipoproteiner er egnede til direkte anvendelse i TLR assays eller til yderligere rensning af SDS-PAGE. For MALDI-TOF MS, overførsel af lipoproteiner til nitrocellulose membran giver en stillads til effektiv i situ trypsin fordøjelse, vask og efterfølgende eluering fra membranen overflade, hvilket resulterer i meget renset N-terminale lipopeptides. Nitrocellulose har vist sig at lette prøve håndtering og forbedre sekvens dækning for meget hydrofobe peptider fra integreret membran proteiner13,14, samt lipoproteiner9,10 . Metoden har den yderligere fordel, fractionating peptider baseret på polaritet, så at mellemliggende vask løsninger kan analyseres for høj genkendelsessikkerhed protein identifikation samtidig med N-terminalen Strukturbestemmelse i en enkelt eksperiment . Denne protokol entydigt funktioner forsætlig natrium addukt dannelse at fremme overordnede ion fragmentering mod dehydroalanyl ioner under MS/MS, medvirken i strukturelle tildeling af N– acylation stat. N-terminus er både variable og mest centrale funktion relateret til TLR anerkendelse af lipoproteiner. Tilsammen har denne protokol tilladt intensiv og reproducerbare studies på lipoproteiner, med de enkelte faser af rensning og Strukturbestemmelse af MALDI-TOF MS nemt tilpasses afhængig af det overordnede mål for eksperimentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen heri beskriver to adskilte faser af lipoprotein karakterisering: berigelse af TX-114 fase opdeling og strukturelle fastsættelse af MALDI-TOF MS. Under TX-114 udvinding fjerner yderligere centrifugering kontaminerende proteiner, der udfældes under denne proces, efterfulgt af acetone nedbør til at give højt beriget lipoproteiner. Ved at begrænse omfanget af hvert præparat til 15 mL værd af celler, kan flere prøver let behandles parallelt, og hvis det ønskes, samles i slutningen af protokollen.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Meredith lab blev støttet af startup midler fra Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi takker Dr. Tatiana Laremore for teknisk rådgivning og adgang til udstyr på Penn State Proteomics og masse massespektrometri Core facilitet, Universitetsparken, PA, hvor massespektrometrisk analyser blev udført.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
