Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie
Summary
De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.
Abstract
Lipoproteïnen zijn belangrijke bestanddelen van de bacteriële celenvelop en krachtige activators van de zoogdieren aangeboren immuunrespons. Ondanks hun belang voor zowel celfysiologie en immunologie, moet nog veel worden ontdekt over roman lipoproteïne formulieren, hoe ze worden gesynthetiseerd en het effect van de verschillende vormen op de immuniteit van de gastheer. Opdat de grondige studies over lipoproteïnen, dit protocol beschrijft een methode voor bacteriële lipoproteïne verrijking en voorbereiding van N-terminale al lipopeptides voor structurele bepaling door laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-tijd van de vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS). Uitbreiding op een gevestigde Triton X-114 fase partitioneren methode voor lipoproteïne winning en de verrijking van de bacteriële cel membraan, het protocol bevat aanvullende stappen om te verwijderen van niet-lipoproteïne contaminanten, lipoproteïne rendement verhogen en zuiverheid. Aangezien lipoproteïnen worden vaak gebruikt in Toll-like receptor (TLR) testen, is het essentieel om eerst het karakteriseren van de structuur van de N-terminal door MALDI-TOF MS. Herein, een methode is bedoeld om te isoleren van geconcentreerde hydrofobe peptiden verrijkt met N-terminal lipopeptides geschikt voor een directe analyse door Lipoproteins van de MALDI-TOF-MS/MS. die zijn gescheiden door Poly-Acrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium Dodecyl Sulfaat worden overgedragen aan een membraan van het nitrocellulose, verteerd in situ met Trypsine, opeenvolgend gewassen om te verwijderen van polar al peptiden, en ten slotte met chloroform-methanol geëlueerd. Wanneer gekoppeld aan MS van de meer polar trypsinized peptiden van wassen oplossingen, biedt deze methode de mogelijkheid om zowel het lipoproteïne te identificeren en te karakteriseren zijn N-terminus in een enkele experiment. Opzettelijke natrium adduct vorming kan ook worden gebruikt als een instrument ter bevordering van meer structureel informatieve fragmentatie spectra. Uiteindelijk, verrijking van lipoproteins en bepaling van hun structuren van N-terminale toestaat meer uitgebreide studies op deze alomtegenwoordige klasse van bacteriële eiwitten.
Introduction
Lipoproteins van de bacteriële worden gekenmerkt door een geconserveerde N-terminale lipide gemodificeerde cysteïne die ankers van het domein van de bolvormige eiwit op het oppervlak van de celmembraan. Ze zijn universeel verspreid in bacteriën, die 2 tot 5% van alle cellulaire genen binnen een typisch genoom1. Lipoproteins van de spelen een kritieke rol in een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder de opname van de voedingsstoffen, signaaltransductie, vergadering van eiwitcomplexen, en ter handhaving cel envelop structurele integriteit2. Pathogene bacteriën dienen lipoproteïnen als virulentie factoren3,4. Erkenning van N-terminal lipopeptides door Toll-like receptor (TLR) 2 aanzet tijdens een infectie, een aangeboren immune reactie op het verwijderen van de invasie ziekteverwekkers. Afhankelijk van de N-terminale acylering staat, zijn de lipoproteïnen algemeen erkend door alternatieve TLR2 heterodimeric complexen. TLR2-TLR1 herkent N-GEACYLEERDE lipopeptides, terwijl TLR2-TLR6 bindt gratis lipopeptide α-amino termini. Eenmaal gebonden, samenkomen de signaalroutes om te induceren secretie van proinflammatoire cytokines3,4.
Eerder werd gedacht dat lipoproteins van gram-positieve bacteriën waren diacylated en die van gram-negatieve bacteriën triacylated, die verschillen in de afwezigheid of de aanwezigheid van een vetzuur amide-linked op het geconserveerde N-terminale cysteine residu. Deze veronderstelling werd gesteund door het ontbreken van reeks orthologs in gram-positieve genoom te Lnt, de gram-negatieve N-acyl-transferase die triacylated lipoproteïnen5vormt. Echter, recente studies is gebleken dat lipoproteïne triacylation in gram-positieve Firmicutes die ontbreken lnt, evenals drie nieuwe N-terminale lipoproteïne structuren, genoemd de peptide, lyso en N –acetyl vormen6,7 ,8. Deze bevindingen stellen vragen over mogelijk nog-te-worden-ontdekt lipoproteïne vormen, naast het fundamentele vragen over de manier waarop deze roman lipoproteins worden gemaakt en welke fysiologische doel of voordeel de verschillende vormen geven. Bovendien tonen zij duidelijk aan het huidige onvermogen van de genomica te voorspellen lipoproteïne structuur. Inderdaad, we onlangs geïdentificeerd een nieuwe klasse van lipoproteïne N-acyl enzym, genaamd Lit, van Enterococcus faecalis en Bacillus cereus , dat lyso-formulier lipoproteïnen9 maakt. Dit wijst op de noodzaak om het experimenteel verifiëren lipoproteïne structuur, die uitdagend vanwege hun zeer hydrofobe aard en de beperkte methoden beschikbaar worden kan voor het karakteriseren van hun moleculaire structuur.
Ter vergemakkelijking van studies over lipoproteïne inductie van de immuunrespons van de gastheer, alsook de structurele vaststelling van N-terminale, hebben we verschillende eerder beschreven protocollen om te zuiveren lipoproteins van de bacteriële en de voorbereiding van de N-terminale al aangepast lipopeptides voor analyse door MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteïnen zijn verrijkt met behulp van een gevestigde Triton X-114 (voortaan aangeduid als oppervlakteactieve stof of TX-114) fase partitioneren methode, met optimalisatie lipoproteïne opbrengst te verwijderen van contaminerende niet-lipoproteïnen. Deze lipoproteins zijn geschikt voor direct gebruik in TLR testen of voor verdere zuivering door SDS-PAGE. Voor MALDI-TOF MS, overdracht van de lipoproteïnen aan het membraan van het nitrocellulose voorziet een steiger efficiënt in situ de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het oppervlak van de membraan, resulterend in sterk gezuiverd N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose is aangetoond dat het oog op het hanteren van de steekproef en verbetering van de reeks dekking voor zeer hydrofobe peptides van integraal membraan eiwitten13,14, evenals lipoproteïnen9,10 . De methode heeft als extra voordeel van peptiden op basis van polariteit, zodat de tussenliggende wassen oplossingen kunnen worden geanalyseerd voor hoge vertrouwen eiwit identificatie gelijktijdig met N-terminale structurele bepaling in een enkele experiment . Dit protocol een unieke functies opzettelijke natrium adduct vorming te bevorderen van bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl ionen tijdens MS/MS, helpend in structurele toewijzing van de N– acylering staat. De N-terminus is zowel de meest variabele en belangrijke functie gerelateerde TLR erkenning van lipoproteïnen. Tezamen, hebben dit protocol intensieve en reproduceerbare studies op lipoproteïnen, met de afzonderlijke fasen van zuivering en bepaling van de structurele door MALDI-TOF MS gemakkelijk aangepast afhankelijk van het algemene doel van het experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hierin beschrijft twee verschillende fasen van de karakterisering van het lipoproteïne: verrijking door TX-114 fase partitionering en structurele bepaling door MALDI-TOF MS. Tijdens de extractie van de TX-114 verwijdert extra centrifugeren contaminerende eiwitten die tijdens dit proces precipiteren, gevolgd door aceton neerslag hoogverrijkt lipoproteïnen opleveren. Door de omvang van elk preparaat aan 15 mL waarde van cellen te beperken, kunnen verschillende monsters worden gemakkelijk verwerkt parallel en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het laboratorium van Meredith werd gesteund door opstarten middelen die door de Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Wij danken Dr. Tatiana Laremore voor deskundig technisch advies en toegang tot de apparatuur op de Penn State Proteomics en massaspectrometrie Core faciliteit, University Park, PA, waar de massaspectrometrische analyses werden uitgevoerd.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
