Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie
Summary
Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.
Abstract
Lipoproteine sind wichtige Bestandteile der bakteriellen Zellhülle und potente Aktivatoren der Säugetier-angeborenen Immunantwort. Trotz ihrer Bedeutung für Zellphysiologie und Immunologie bleibt noch viel um zu entdecken über neuartige Lipoprotein Formen, wie sie synthetisiert werden und die Wirkung der verschiedenen Formen auf wirtsimmunität. Um gründliche Studien über Lipoproteine zu ermöglichen, dieses Protokoll beschreibt eine Methode für bakterielle Lipoprotein Bereicherung und Vorbereitung der N-terminalen tryptic Lipopeptide für die Strukturaufklärung von Matrix-assisted Laser desorption ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS). Erweiterung auf einer etablierten Triton X-114 Phase Partitionierung Methode für die Extraktion von Lipoprotein und Anreicherung von der bakteriellen Zellmembran, das Protokoll enthält zusätzliche Schritte aus, um nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, Lipoprotein Ertragssteigerung zu entfernen und Reinheit. Da Lipoproteine in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Assays allgemein verwendet sind, ist es wichtig, zunächst die N-terminalen Struktur von MALDI-TOF MS. hierin charakterisieren, ein Verfahren vorgestellt, um konzentrierter hydrophobe Peptide in N-terminale angereichert zu isolieren Lipopeptide geeignet für die direkte Analyse von MALDI-TOF-MS/MS.-Lipoproteine, die von Sodium Dodecyl Sulfat Poly-Acrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt wurden auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, in Situ mit verdaut Trypsin, gegenüber dem Vorquartal um polare tryptic Peptide zu entfernen gewaschen und schließlich mit Chloroform-Methanol eluiert. Wenn in Verbindung mit MS mehr polare trypsiniert Peptide aus Waschlösungen, bietet diese Methode die Möglichkeit, sowohl das Lipoprotein zu identifizieren und zu charakterisieren seine N-Terminus in einem einzigen Experiment. Absichtliche Natrium Addukt Bildung können auch als Werkzeug eingesetzt werden, um mehr strukturell informative Fragmentierung Spektren zu fördern. Letztlich werden Bereicherung der Lipoproteine und Bestimmung ihrer N-terminale Strukturen umfangreichere Studien auf diese allgegenwärtige Klasse bakterielle Proteine erlauben.
Introduction
Bakterielle Lipoproteine zeichnen sich durch eine konservierte N-terminale Lipid-modifizierten Cystein, die die kugelförmige Protein-Domäne an die Oberfläche der Zellmembran verankert. Sie verteilen sich universell in Bakterien, bildet 2 bis 5 % aller zellulärer Gene innerhalb einer typischen Genom-1. Lipoproteine spielen eine kritische Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Nährstoffaufnahme, Signaltransduktion, Montage von Proteinkomplexen und bei der Aufrechterhaltung der Zelle Umschlag strukturelle Integrität2. Bei pathogenen Bakterien dienen Lipoproteine als Virulenz Faktoren3,4. Während einer Infektion stachelt Anerkennung der N-terminalen Lipopeptide von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 2 eine angeborene Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger zu entfernen. Je nach dem N-terminalen Acylation Zustand sind Lipoproteine Alternative TLR2-heterodimerisierenden-komplexe in der Regel anerkannt. TLR2-TLR1 erkennt N-Acylated Lipopeptide, während TLR2-TLR6 bindet freie Lipopeptide α-Aminosäure Termini. Einmal gebunden, konvergieren die Signalwege induzieren Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen3,4.
Früher dachte man, dass Lipoproteine von gram-positiven Bakterien Diacylated und die von Gram-negativen Bakterien Triacylated waren, unterscheiden sich in das Fehlen oder Vorhandensein einer Amid-linked Fettsäure auf der erhaltenen N-terminalen Cystein Rückstand. Diese Annahme wurde durch den Mangel an Sequenz Orthologe in gram-positiven Genomen, Lnt, Gram-negative N-Acyl-Transferase unterstützt, die Triacylated Lipoproteine5bildet. Jedoch haben neuere Studien Lipoprotein Triacylation in gram-positiven Firmicuten, dass fehlende Lnt, sowie drei neuartige N-terminale Lipoprotein Strukturen bezeichnet die Peptidyl, Lyso und N –Acetyl Formen6,7 gezeigt. ,8. Diese Erkenntnisse werfen Fragen über mögliche noch entdeckt Lipoprotein Formen, neben grundlegende Fragen wie diese neuartige Lipoproteine entstehen und welche physiologischen Zweck oder nutzen die verschiedenen Formen vermitteln. Darüber hinaus zeigen sie die aktuelle Unfähigkeit der Genomik, Lipoprotein Struktur Vorhersagen. In der Tat haben wir vor kurzem eine neuartige Klasse von Lipoprotein-N-Acyl-Transferasen, Lit, von Enterococcus Faecalis und Bacillus Cereus , das Lyso-Formular Lipoproteine9macht aufgerufen. Dies zeigt die Notwendigkeit, die aufgrund ihrer extrem hydrophoben Charakters und begrenzte Methoden zur Verfügung, um ihre molekulare Struktur charakterisieren eine Herausforderung sein Lipoprotein Struktur, experimentell zu überprüfen.
Um Studien auf Lipoprotein Induktion der Host Immunantwort sowie die N-terminale Strukturaufklärung zu erleichtern, haben wir mehrere zuvor beschriebenen Protokolle um bakterielle Lipoproteine reinigen und Vorbereiten der N-terminalen tryptic angepasst Lipopeptide für die Analyse von MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteine sind angereichert mit einer etablierten Triton X-114 (im folgenden als Tensid oder TX-114 bezeichnet) Phase Partitionierung Methode, mit der Optimierung zu entfernen Verunreinigungen nicht-Lipoproteine und Lipoprotein Ertrag zu steigern. Diese Lipoproteine sind geeignet für den direkten Einsatz in TLR Tests oder für weitere Reinigung durch SDS-PAGE. Für MALDI-TOF MS Übertragung der Lipoproteine auf Nitrozellulose-Membran bietet ein Gerüst für die effiziente in Situ Trypsin-Verdauung waschen und anschließende Elution von der Membranoberfläche, was zu sehr gereinigt N-terminale Lipopeptide. Nitrozellulose nachweislich Probenbehandlung Erleichterung und Verbesserung des Sequenz-Abdeckung für stark hydrophobe Peptide aus integrale Membrane Proteine13,14, sowie Lipoproteine9,10 . Die Methode hat den zusätzlichen Vorteil der Fraktionierung Peptide basierend auf Polarität, so dass fortgeschrittene Waschlösungen für hohes Vertrauen Proteinidentifikation gleichzeitig mit N-terminale Strukturaufklärung in einem einzigen Experiment analysiert werden können . Dieses Protokoll eindeutig Merkmale vorsätzliche Natrium Addukt Bildung, übergeordnete Ion Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl-Ionen während MS/MS, Beihilfe bei der strukturellen Zuordnung des N– Acylation Staates zu fördern. Der N-Terminus ist variabel und wichtige Funktion im Zusammenhang mit TLR Anerkennung der Lipoproteine. Zusammengenommen hat dieses Protokoll auf Lipoproteine, mit den einzelnen Stufen der Reinigung und Strukturaufklärung von MALDI-TOF MS leicht angepasst, je nach Ziel des Experiments intensive und reproduzierbare Studien erlaubt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hierin beschreibt zwei Phasen der Lipoprotein-Charakterisierung: Anreicherung von TX-114 phase Partitionierung und strukturellen Bestimmung durch MALDI-TOF MS. Während der TX-114 Extraktion entfernt zusätzliche Zentrifugation kontaminierende Proteine, die während dieses Prozesses, gefolgt von Aceton Niederschlag hochangereichertem Lipoproteine Ausbeute auszufällen. Durch die Begrenzung des Ausmaßes der jede Vorbereitung auf 15 mL im Wert von Zellen, können mehrere Proben problemlos parallel verarbeite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung im Labor Meredith wurde von Start-up aus Mitteln der Eberly Hochschule der Wissenschaft (Pennsylvania State University) unterstützt. Wir danken Dr. Tatiana Laremore für kompetente technische Beratung und Zugang zu Geräten an der Penn State Proteomics und Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, wo massenspektrometrische Analysen durchgeführt wurden.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
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