Anrikning av bakteriell lipoproteiner och beredning av N-terminala Lipopeptides för strukturella bestämning genom masspektrometri
Summary
Anrikningen av bakteriell lipoproteiner med hjälp av en icke-jonisk tensid fas partitionering metod beskrivs för direkt användning i TLR analyser eller andra program. Ytterligare åtgärder är detaljerade för att förbereda N-terminala tryptic lipopeptides för strukturell karaktärisering av masspektrometri.
Abstract
Lipoproteiner är viktiga beståndsdelar av bakteriell cell kuvertet och potent aktivatorer av däggdjur medfödda immunsvar. Trots sin betydelse för både cellfysiologi och immunologi återstår mycket upptäckas om romanen lipoprotein formulär, hur de syntetiseras och effekten av olika former på värd immunitet. För att möjliggöra noggranna studier på lipoproteiner, det här protokollet beskriver en metod för bakteriell lipoprotein anrikning och beredning av N-terminala tryptic lipopeptides för strukturella bestämning av matrix-assisted laser desorption jonisering-tiden för flygningen masspektrometri (MALDI-TOF MS). Expanderande på en etablerad Triton X-114 fas partitionering metod för lipoprotein utvinning och berikning från bakteriell cellmembranet, protokollet innehåller ytterligare steg för att avlägsna icke-lipoprotein föroreningar, öka lipoprotein avkastning och renhet. Eftersom lipoproteiner används ofta i Toll-liknande receptorer (TLR) analyser, är det viktigt att först karakterisera den N-terminala strukturen av MALDI-TOF MS. häri, presenteras en metod för att isolera koncentrerad hydrofoba peptider berikad i N-terminal lipopeptides passar direkt analys av MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner som skilts av Sodium Dodecyl Sulfate Poly-akrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) överförs till en nitrocellulosa membran, rötas i situ med Trypsin, tvättas sekventiellt för att ta bort polar tryptic peptider och slutligen elueras med kloroform-metanol. När tillsammans med MS av de mer polar trypsinized peptiderna från tvätta lösningar, ger metoden möjlighet att både identifiera Lipoproteinen och karakterisera dess N-terminalen i ett enda experiment. Avsiktlig natrium addukt bildandet kan också användas som ett verktyg för att främja mer strukturellt informativ fragmentering spectra. Slutändan, anrikning av lipoproteiner och bestämning av N-terminala strukturerna kommer att tillåta mer omfattande studier på denna allestädes närvarande klass av bakteriella proteiner.
Introduction
Bakteriella lipoproteiner kännetecknas av ett bevarat N-terminala lipid-modifierade cystein som förankrar globulära protein domänen till cellmembran ytan. De fördelas universellt i bakterier, som utgör 2-5% av alla cellulära gener inom en typisk genomet1. Lipoproteiner spela avgörande roller i en mängd olika cellulära processer, inklusive näringsupptag, signaltransduktion, montering av proteinkomplex, och att upprätthålla cell kuvertet strukturell integritet2. I patogena bakterier tjäna lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infektion uppviglar erkännande av N-terminala lipopeptides av Toll-liknande receptorer (TLR) 2 ett medfödda immunsvar ta bort invaderande patogener. Beroende på den N-terminala acylation staten, är lipoproteiner allmänt erkända av alternativa TLR2 heterodimeriskt komplex. TLR2-TLR1 erkänner N-acylated lipopeptides, medan TLR2-TLR6 binder gratis lipopeptidsubstans α-amino termini. Bindning, konvergerar signalvägar som för att framkalla utsöndring av proinflammatoriska cytokiner3,4.
Tidigare trodde man att lipoproteiner från grampositiva bakterier var diacylated och de från gramnegativa bakterier var triacylated, skiljer sig i frånvaron eller närvaron av en fettsyra Amid-länkade på de bevarade N-terminala cysteinrest. Detta antagande stöds av bristen på sekvens orthologs i grampositiva genom att Lnt, den gramnegativa N-acyl-transferas som bildar triacylated lipoproteiner5. Men visat senare studier lipoprotein triacylation i grampositiva Firmicutes att avsaknaden lnt, samt tre nya N-terminala lipoprotein strukturer, kallas den peptidyl, lyso och N –acetyl former6,7 ,8. Dessa fynd ställa frågor om möjligt ännu-till-vara-upptäckte lipoprotein bildar, tillsammans med grundläggande frågor om hur dessa nya lipoproteiner görs och vilka fysiologiska ändamål eller fördel olika former sprida. De visar dessutom tydligt genomik nuvarande oförmåga att förutsäga lipoprotein struktur. Ja, vi har nyligen identifierat en ny klass av lipoprotein N-acyl transferaser, kallas Lit, från Enterococcus faecalis och Bacillus cereus som gör lyso-form lipoproteiner9. Detta tyder på att experimentellt verifierar lipoprotein struktur, som kan vara utmanande på grund av sin extremt hydrofoba natur och begränsad metoder tillgängliga att karakterisera deras molekylära struktur.
För att underlätta studier av lipoprotein induktion av den värd immunsvar, samt N-terminala strukturella beslutsamhet, har vi anpassat flera tidigare beskrivna protokoll för att rena bakteriell lipoproteiner och förbereda den N-terminalen tryptic lipopeptides för analys av MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner är berikad med en etablerad Triton X-114 (hädanefter kallad surfaktant eller TX-114) fas partitionering metod, med optimering för att ta bort kontaminerande icke-lipoproteiner och öka lipoprotein avkastningen. Dessa lipoproteiner är lämpliga för direkt användning i TLR analyser eller för ytterligare rening av SDS-PAGE. För MALDI-TOF MS, överföring av Lipoproteinerna till nitrocellulosa membranet ger en byggnadsställning för effektiv i situ trypsin matsmältningen, tvätt och efterföljande eluering från membran yta, vilket resulterar i mycket renad N-terminala lipopeptides. Nitrocellulosa har visat sig underlätta provhantering och förbättra sekvens täckning för starkt hydrofoba peptider från integrerad membran proteiner13,14, liksom lipoproteiner9,10 . Metoden har den ytterligare fördelen att installera peptider baserat på polaritet, så att mellanliggande tvätta lösningar kan analyseras för högt förtroende protein identifiering samtidigt med N-terminala strukturella bestämning i en enda experiment . Detta protokoll unikt funktioner avsiktliga natrium addukt bildandet att främja överordnade ion fragmentering mot dehydroalanyl joner under MS/MS, medhjälp i strukturella tilldelningen av N– acylation staten. N-terminalen är både varierande och mest viktiga funktionen relaterade till TLR erkännande av lipoproteiner. Sammantaget har detta protokoll tillåtna intensiv och reproducerbara undersökningar på lipoproteiner, med de enskilda stegen i rening och strukturella bestämning av MALDI-TOF MS anpassas beroende på det övergripande målet för experimentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet häri beskriver två olika faser av lipoprotein karakterisering: anrikning av TX-114 fas partitionering och strukturella bestämning av MALDI-TOF MS. Under TX-114 extraktion avlägsnar ytterligare centrifugering kontaminerande proteiner som fällningen under denna process, följt av aceton utfällning avkastning höganrikat lipoproteiner. Genom att begränsa omfattningen av varje beredning till 15 mL värt av celler, kan flera prover enkelt bearbetas parallellt, och om så önskas, poolade i slutet av protoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Meredith labbet stöddes av start medel som tillhandahålls av den Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi tackar Dr. Tatiana Laremore för tekniska expertråd och tillgång till utrustning vid Penn State Proteomik och Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, där massa spektrometriska analyser utfördes.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
