Un modèle murin de nerf sciatique In Vivo Perineural invasion

Summary

Nous décrivons un modèle murin in vivo de perineural invasion en injectant des cellules de cancer du pancréas syngénique dans le nerf sciatique. Le modèle permet de quantifier l’ampleur de l’invasion du nerf et prend en charge l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de perineural invasion.

Abstract

Cellules cancéreuses envahissent les nerfs par un processus appelé perineural invasion (PNI), dans laquelle le cancer cellules prolifèrent et migrent dans le microenvironnement de nerf. Ce type d’invasion est exposé par une variété de types de cancer et le trouve très fréquemment dans le cancer pancréatique. La taille microscopique des fibres nerveuses au sein du pancréas de souris complique l’étude des PNI dans les modèles murins orthotopique. Nous décrivons ici un modèle hétérotopique in vivo du PNI, où nous injectons lignée cellulaire de cancer du pancréas syngénique Panc02-H7 dans le nerf sciatique murin. Dans ce modèle, les nerfs sciatiques des souris anesthésiés sont exposés et une injection de cellules cancéreuses. Les cellules cancéreuses envahissent les nerfs dans la partie proximale vers la moelle épinière du point d’injection. Les nerfs sciatiques envahies sont ensuite extraits et traités avec OCT pour le sectionnement gelé. H & E et immunofluorescence souillant de ces sections permettent de quantifier le degré d’invasion et les changements dans l’expression de la protéine. Ce modèle peut être appliqué à une variété d’études ÉIN compte tenu de sa polyvalence. Utilisant des souris avec différentes modifications génétiques et/ou de différents types de cellules cancéreuses permet pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la PNI et différents cancers. En outre, les effets d’agents thérapeutiques sur l’invasion de nerf peuvent être étudiés en appliquant le traitement de ces souris.

Introduction

Nerfs forment un micro-environnement tumoral spécifique qui stimule le cancer prolifération et la migration^1,2,3. Perineural invasion (PNI) est le processus par l’intermédiaire de laquelle le cancer cellules envahissent dans et autour des nerfs. Il peut être considéré comme un itinéraire unique de métastases depuis l’invasion du cancer s’étend loin des sites d’origine le long des nerfs. PNI se trouve dans plusieurs types de cancer, notamment du pancréas, la prostate, la tête & cou, glandes salivaire, col de l’utérus et le cancer du côlon avec une incidence variant de 22 % à 100 %^1,2. PNI est associée à la douleur et est corrélée avec un pronostic sombre et pire survie taux^1,2.

Élaborer des modèles de perineural invasion est essentiel pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires de ce processus et de tester des agents thérapeutiques candidat pour diminuer la PNI. Méthodes in vitro d’étudier les interactions entre les cancers et les nerfs comprennent la co-culture de cellules cancéreuses avec nerf explants⁴, racine dorsale ganglions^5,6,7ou des cellules spécifiques microenvironnement comme Schwann du nerf cellules de⁷. In vivo des approches, toutefois, sont plus physiologiquement pertinents, comprennent l’utilisation de modèles de souris cancer dont le cancer a été induite par ou transplanté et ont l’avantage de la comptabilité pour le microenvironnement toute nerveuse. Dans orthotopique modèles de cancer du pancréas ou de la prostate, PNI a été rapporté^8,9,10 et l’incidence des PNI peut-être être enregistrée, mais en raison de l’exiguïté des nerfs dans les organes, il est difficile de voir le nerf ensemble et donc de quantifier l’ampleur du PNI. Le modèle que nous décrivons ici est un modèle in vivo des PNI dans laquelle le cancer, les cellules sont injectées dans le nerf sciatique de souris grâce à une intervention chirurgicale simple¹¹. La greffe hétérotopique envahit dans le nerf vers la moelle épinière. La longueur de l’invasion de nerf du site d’injection à la moelle épinière peut être mesurée, ainsi que le volume du cancer dans le nerf. Ce qui est important, le nerf envahi peut également être collecté pour une variété de tests, y compris des analyses microscopiques et moléculaires. Une variété de cellules cancéreuses peut être testée, et les souris de l’hôte qui ont été génétiquement modifiés ou traités avec des composés spécifiques peuvent être utilisés aussi bien. Ce dosage puissant permet les cellules cancéreuses et le micro-environnement de l’hôte à modifier pour l’enquête sur les mécanismes de la PNI.

Protocol

Toutes les procédures avec les sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme au Memorial Sloan Kettering Cancer Center et d’institutionnels animalier. 1. préparation des cellules cancéreuses Récolte des Panc02-H7 confluentes avec 0,25 % de trypsine pendant 5 min à 37 ° C. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL.Remarque : Les cellules sont cultivées dans le ballon de T-225, qui contient environ 12 x 106 cellules / fiol…

Representative Results

Cette méthode décrit l’implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas dans le nerf sciatique murin pour créer un modèle in vivo d’invasion du nerf quantifiables. La figure 1 illustre la localisation anatomique du nerf sciatique et le point d’injection. La figure 2 montre les deux nerfs sciatiques de souris nude. Un nerf de PBS injecté (à gauche) peut être comparé à un nerf injecté avec des …

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un modèle murin in vivo d’invasion péri-radiculaire qui permet la quantification du nerf sciatique invasion par des cellules de cancer du pancréas. Ce modèle permet l’étude des mécanismes moléculaires de l’invasion du nerf. Expériences réussies à l’aide de cette technique nécessitent une approche attentive à trois étapes essentielles du processus : 1) l’injection de cellules cancéreuses (étapes 2.7, 2.8), 2) l’extraction des nerfs envahies (étape 3….

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1