Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

Summary

Describimos un modelo murino en vivo de invasión perineural por células de cáncer pancreático syngeneic de inyección en el nervio ciático. El modelo permite la cuantificación del grado de invasión del nervio y apoya la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la invasión perineural.

Abstract

Las células cancerosas invaden los nervios a través de un proceso denominado la invasión perineural (PNI), en que el cáncer de las células proliferan y migran en el microambiente del nervio. Este tipo de invasión es exhibido por una variedad de tipos de cáncer y se encuentra muy frecuentemente en el cáncer de páncreas. El tamaño microscópico de fibras nerviosas en páncreas de ratón hace que el estudio de PNI difícil en modelos murinos de orthotopic. Aquí, describimos un modelo de heterotopic en vivo de PNI, donde inyectamos la línea celular de cáncer de páncreas syngeneic Panc02-H7 en el nervio ciático murino. En este modelo, nervios ciáticos de ratones anestesiados son expuestos e inyectados con las células cancerosas. Las células cancerosas invaden en los nervios proximalmente hacia la médula espinal desde el punto de inyección. Los nervios ciáticos invadidos entonces son extraídos y procesados con OCT para secciones congeladas. H & E y tinción de inmunofluorescencia de estas secciones permiten la cuantificación del grado de invasión y los cambios en la expresión de la proteína. Este modelo puede aplicarse a una variedad de estudios sobre PNI dada su versatilidad. Usando ratones con modificaciones genéticas diferentes o diferentes tipos de células cancerosas permite para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la PNI y para tipos de cáncer diferentes. Además, los efectos de agentes terapéuticos en la invasión del nervio pueden ser estudiados mediante la aplicación de tratamiento a estos ratones.

Introduction

Los nervios forman un microambiente tumoral específica que estimula cáncer crecimiento y migración^1,2,3. La invasión perineural (PNI) es el proceso a través del cual cáncer células invaden en y alrededor de los nervios. Puede considerarse como una única vía de metástasis ya que invasión de cáncer se extiende a los sitios de origen a lo largo de los nervios. PNI se encuentra en varios tipos de cáncer incluyendo páncreas, próstata, cabeza y cuello, salival, cervical y cáncer colorrectal con una incidencia que van desde 22% a 100%^1,2. PNI es asociado con dolor y se correlaciona con mal pronóstico y peor supervivencia tarifas^1,2.

Desarrollando modelos de invasión perineural es esencial para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de este proceso y a prueba de agentes terapéuticos candidato para disminuir PNI. In vitro métodos de estudio de las interacciones entre los cánceres y los nervios son el cocultivo de las células cancerosas con nervio explantes⁴, raíz dorsal ganglios^5,6,7o con células específicas del nervio microambiente como Schwann las células⁷. Métodos in vivo , sin embargo, son más fisiológicamente relevantes, incluyen el uso de modelos de ratón de cáncer que el cáncer ha sido inducido o trasplantado y tienen la ventaja de la contabilidad para el microambiente entero del nervio. En orthotopic del modelos de cáncer de páncreas o próstata, PNI ha sido reportados^8,9,10 y puede registrar la incidencia de la PNI, pero debido al pequeño tamaño de los nervios en los órganos, es difícil ver el nervio todo y por lo tanto, para cuantificar el grado de PNI. El modelo que se describe aquí es un modelo en vivo de PNI en que el cáncer de las células se inyectan en el nervio ciático de los ratones a través de una sencilla intervención quirúrgica¹¹. El trasplante heterotópico invade dentro del nervio hacia la médula espinal. Puede medirse la longitud de la invasión del nervio desde el sitio de inyección en la médula espinal, así como el volumen del cáncer dentro del nervio. Lo importante es el nervio invadido también puede recogerse para una variedad de análisis incluyendo análisis microscópicos y moleculares. Una variedad de células de cáncer puede ser probada, y los ratones de host que han modificado genéticamente o tratados con compuestos específicos pueden utilizarse también. Este ensayo potente permite a las células cancerosas y el microambiente de host modificado para la investigación en los mecanismos de PNI.

Protocol

Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center. 1. preparación de las células cancerosas Cosecha el confluente Panc02 H7 células con tripsina 0.25% por 5 min a 37 ° C. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL.Nota: Las células se cultivan en frasco T-225, que contiene aproximadamente 12 x 106 células cada frasco en la confluencia del 80% y 4 mL…

Representative Results

Este método describe la implantación quirúrgica de las células de cáncer de páncreas en el nervio ciático murino para crear un modelo en vivo de invasión del nervio cuantificables. La figura 1 muestra la localización anatómica del nervio ciático y el sitio de inyección. La figura 2 muestra los dos nervios ciático de un ratón desnudo. Un nervio de PBS inyectado (izquierda) puede ser comparado con un nervio …

Discussion

En este protocolo se describe un modelo murino en vivo de la invasión perineural que permite la cuantificación de la invasión del nervio ciático por las células de cáncer de páncreas. Este modelo permite el estudio de mecanismos moleculares de la invasión del nervio. Experimentos exitosos con esta técnica requieren un cuidadoso enfoque a tres pasos críticos en el proceso de: 1) la inyección de las células cancerosas (pasos 2.7, 2.8), 2) la extracción de nervios invadidos (paso 3.4) y 3) procesamient…

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1