En In Vivo murina ischiasnerven modell av Perineural Invasion

Summary

Vi beskriver en i vivo murina modell av perineural invasion genom att injicera syngena pankreascancer celler i ischiasnerven. Modellen möjliggör kvantifiering av omfattningen av nerv invasion, och stöder utredningen av de cellulära och molekylära mekanismerna av perineural invasion.

Abstract

Cancercellerna invaderar nerver genom en process som kallas perineural invasion (PNI), i vilken cancer celler förökar sig och vandrar i den nerv mikromiljö. Denna typ av invasion är utställda av en mängd olika typer av cancer, och mycket ofta finns cancer i bukspottskörteln. Mikroskopiska storlek av nervfibrer inom mus bukspottkörteln gör studien av PNI svårt i ortotop murina modeller. Här beskriver vi en heterotopisk i vivo modell av PNI, där vi injicera syngena pankreascancer cellinje Panc02-H7 i murina ischiasnerven. I den här modellen är höftnerver sövda möss utsatta och injiceras med cancerceller. Cancercellerna invaderar i nerverna proximalt mot ryggmärgen från peka av injektion. Invaderade höftnerver sedan extraheras och bearbetas med OCT för frysta snittning. H & E och immunofluorescens färgning av dessa avsnitt kan kvantifiering av både graden av invasionen och förändringar i proteinuttryck. Denna modell kan tillämpas på en mängd studier på PNI ges dess mångsidighet. Om du använder möss med olika genetiska modifieringar och/eller olika typer av cancerceller kan för utredning av PNI cellulära och molekylära mekanismer och för olika cancertyper. Dessutom kan effekterna av terapeutiska medel på nerv invasion studeras genom att dessa möss behandling.

Introduction

Nerverna bildar en specifik tumör närmiljön som främjar cancer tillväxt och migration^1,2,3. Perineural invasion (PNI) är den process genom vilken cancer celler invadera i och runt nerverna. Det kan betraktas som en unik rutt av metastaser eftersom cancer invasion sträcker sig från platserna för ursprung längs nerverna. PNI finns i flera typer av cancer inklusive bukspottskörteln, prostatacancer, huvud och hals, saliv, livmoderhalscancer, och kolorektal cancer med en incidens som sträcker sig från 22% till 100%^1,2. PNI är förknippad med smärta och korrelerar med dålig prognos och sämre överlevnad priser^1,2.

Utveckla modeller för perineural invasion är viktigt att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna av denna process, och att testa kandidaten terapeutiska medel för att minska PNI. In vitro -metoder för att studera interaktioner mellan cancer och nerver inkluderar samtidig kulturen av cancerceller med nerv bladsticklingar⁴, dorsalrotsganglier ganglier^5,6,7, eller specifika celler från nerv celler mikromiljö såsom Schwann⁷. In vivo -metoder, men är mer fysiologiskt relevanta, inkluderar användning av cancer musmodeller där cancer har inducerad eller transplanteras och har fördelen av redovisning för den hela nerven mikromiljö. I ortotop modeller av bukspottskörteln eller prostata cancer, PNI har varit rapporterade^8,9,10 och incidensen av PNI kan registreras, men på grund av den lilla storleken på nerverna i dessa organ, det är svårt att se hela nerven och därför att kvantifiera omfattningen av PNI. Den modell som vi beskriver här är en in-vivo -modell av PNI i vilken cancer celler injiceras i ischiasnerven möss genom ett enkelt kirurgiskt ingrepp¹¹. Heterotop transplantationen invaderar inom nerven mot ryggmärgen. Längden på nerv invasionen från platsen av injektion till ryggmärgen kan mätas, liksom volymen av cancer inom nerven. Ännu viktigare, kan invaderade nerven också samlas för en mängd olika analyser inklusive mikroskopiska och molekylära analyser. En mängd cancerceller kan testas och värd möss som har modifierats genetiskt eller behandlas med specifika föreningar kan användas också. Denna kraftfulla analys gör att cancercellerna och den värd närmiljön kan ändras för utredning av mekanismerna av PNI.

Protocol

Alla förfaranden med animaliska ämnen godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid Memorial Sloan Kettering Cancer Center. 1. beredning av cancerceller Skörda sub konfluenta Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin för 5 min vid 37 ° C. Samla in cellerna i ett 15 mL centrifugrör.Obs: Cellerna odlas i T-225 kolv, som innehåller ca 12 x 106 celler per kolv på 80% konfluens och 4 mL trypsin / kolv används. Centrifugera cellerna på …

Representative Results

Denna metod beskriver kirurgisk implantation av pankreascancer celler i murina ischiasnerven att skapa en in-vivo -modell av kvantifierbara nerv invasion. Figur 1 illustrerar den anatomiska läge av ischiasnerven och injektionsstället. Figur 2 visar två höftnerver av en naken mus. En PBS injiceras-nerv (vänster) kan jämföras med en nerv som injiceras med MiaPaCa-2 cancerceller (höger). Den nerv som injiceras med …

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en in-vivo murina modell av perineural invasion som möjliggör kvantifiering av ischiasnerven invasion av pankreascancer celler. Denna modell gör det möjligt för studier av molekylära mekanismer av nerv invasion. Framgångsrika experiment med denna teknik kräver en noggrann inställning till tre kritiska steg i processen: 1) injektion av cancerceller (steg 2.7, 2.8), 2) utvinning av invaderade nerver (steg 3,4), och 3) bearbetning av skördade nerver (steg 4.1).

<p class=…

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1