催吐剂节间培养中内源生长素和细胞分裂细胞的量化
Summary
无激素治疗的催吐剂茎段可诱发不定芽。为了评价不定芽形成过程中的激素动态, 我们用 LC-ms/ms 测定了茎段内源性生长素和细胞分裂素。
Abstract
不定芽形成是重要的技术, 对重要作物的繁殖和转基因植物的再生。在大多数物种中诱导不定芽需要激素治疗。不定芽能否诱发是由生长素与细胞分裂素 (CK) 水平的平衡决定的。大量的努力, 以确定最佳的浓度和组合激素在每个组织作为外植体和在每个植物物种。在催吐剂中, 无激素处理可诱导培养基中茎段的不定芽。这使得催吐剂的内在可塑性可以被评估。为了诱导催吐剂中的不定芽, 我们在15µmol m−2 s−1的茎段中培养了24摄氏度, 在14小时 light/10-h 黑循环中, 在无激素 B5 培养基上固化0.2% 结冷胶胶5周。通过液相色谱-串联质谱 (LC ms) 测定了不定芽形成过程中的激素动态, 并对 indole-3-acetic 中的内源性酸和中正进行了检测。这种方法可以简单地分析内源性 indole-3-acetic 酸和中正水平。可用于研究其他植物器官中内源生长素和 CK 的动态变化。
Introduction
Haberlandt (1854-1945) 提出了 “全能” 的概念, 在成熟植物中, 植物细胞可以分化、分化和再生整个植物, 甚至在它们的前向特定细胞类型的差异1。在组织培养中, 能否诱导植物再生是由外部在生长培养基中应用激素的组合和浓度决定的。Skoog 和米勒发现, 在含有高中正比植物生长素的培养基上, 烟草愈伤组织可诱导不定芽, 而不定根可在含有低比值2 的培养基上诱导。自此发现以来, 组织培养已广泛用于经济重要作物的繁殖和转基因植物的再生3。不定芽可诱导从其他组织以外的茎尖分生, 如叶, 根, 和节间。在大多数植物中诱导不定芽需要激素治疗。然而, 最佳的浓度和组合不同的物种和组织之间作为外植体。因此, 大量的努力去确定激素的最佳浓度和组合的实验。
Carapichea ipecacuanha(Brot)l. 安德森 (催吐剂) 是一种药用植物, 含有吐根碱和 cephaeline 等生物碱, 主要在根4 中。根提取物用作祛痰、催吐剂和 amoebicide5。虽然催吐剂自然生长在巴西的热带雨林中, 但它不愿意在文化中设置种子, 在日本的种子储藏过程中, 发芽率下降, 气候较冷的6。相反, 它传播的组织培养, 在节间不定的拍摄形成是最有效的方法7,8。有趣的是, 不定芽可以诱导在这个物种没有激素治疗8。
不定芽形成于茎节顶端区域的表皮上, 不愈伤组织, 但不在基底区域9。这种差异表明茎段的组织极性, 这可能是在 phytohormonal 调节。催吐剂培养系统允许一个独特的机会来分析在不定芽形成期间内源激素水平的变化。在这里, 我们介绍了分析一个生长素 (indole-3-acetic 酸 (IAA)) 和四中正 (isopentenyl 腺嘌呤 (iP), isopentenyl 腺嘌呤核苷 (iPR),反式-玉米 () 和反式-玉米核苷 (tZR) 的内生水平的方法。在茎段中通过使用 LC/ms。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了确定参与器官激素的分布, 重要的是使用植物材料在无激素培养基上观察器官, 因为当激素被外部应用于外植体诱导芽或根, 它们影响整个外植体, 使得很难评价植物的内在可塑性的细胞分化和器官。不定芽可诱导其他植物的无激素培养基 (如石竹石竹L.11、 Aegle marmelos (l.) Corrêa12、 Bacopa 床子(l.) Pennell13, 藤苋菜。<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢东洋大学应用生物科学系的 Koudai 先生和群马县农业技术中心谷口先生的技术援助。我们还感谢 Shosaku Kashiwada 教授和东洋大学 Maheswari Rajagopalan 博士的建议。这项研究由东洋大学生命与环境科学研究中心部分支持。
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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