Summary

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Published: January 02, 2018
doi:

Summary

Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans– ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Abstract

Çentik sinyal geniş hayvan geliştirme ve yetişkin bakım ve kullanılan bir evrimsel korunmuş hücre-hücre iletişim sistemidir. Çentik reseptör hücreleri komşu gelen ligandlar ile etkileşimi sinyal aktivasyonu neden olmaktadır (trans-harekete geçirmek), sinyal ligandlar aynı hücreden ile etkileşim inhibe ederken (CIS-inhibisyon). Transarasındaki uygun dengeyi-harekete geçirmek ve BDT-inhibisyon yardımcı olur çentik bazı bağlamlarda hayvan geliştirme sırasında sinyal en uygun belirlemektedir. Üst üste gelen ifade etki alanları çentik ve birçok hücre tipleri içinde onun ligandlar ve geri bildirim mekanizmaları varlığı nedeniyle verilen translasyonel modifikasyon transCISkarşı üzerinde etkileri eğitimi-çentik etkileşimleri ve onun ligandlar vivo içinde zordur. Burada, Drosophila S2 hücrelerde hücre toplama deneyleri çentik bağlama trans ve CISher ligand için üzerinde bir çentik yol değiştirici aşağı vurma etkilerini değerlendirmek amacıyla kullanmak için bir iletişim kuralı açıklar. Stabil veya geçici bir çentik ifade vektör ile transfected S2 hücreleri her çentik ligand (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade hücreleri ile karıştırılır. Trans-reseptör ligandlar arasındaki bağı heterotypic hücre toplamları oluşumuna neden olur ve oluşan mL başına toplamları sayısı açısından ölçülür > 6 hücreler. CISinhibitör etkisini incelemek için-ligandlar, çentik ve her ligand ortak ifade S2 hücreleri S2-Delta veya S2 Serrate hücreleri ile karıştırılır ve toplamları sayısı yukarıda açıklandığı gibi sayılabilir. CISvarlığı nedeniyle toplamları sayısı göreli düşüş-ligandlar CISölçüsü sağlar-ligand- transinhibisyonu aracılı-bağlama. Bu basit deneyleri genetik veya farmakolojik işlemler bağlama üzerinde çentik için onun ligandlar etkileri üzerinde yarı Nicel veri sağlayabilir ve in vivo etkileri altında yatan moleküler mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir Çentik sinyal üzerinde böyle manipülasyonlar.

Introduction

Kurallı sinyal çentik çentik reseptörleri ve onların ligandlar1arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hücreler komşu fiziksel temas gerektiren bir kısa menzilli hücre-hücre iletişim mekanizmasıdır. Çentik reseptör (sinyal alma hücrelerinin yüzeyinde mevcut) etkileşim ligandlar (sinyal gönderme yüzeyinde mevcut hücreleri) çentik sinyal başlatır ve transbilinen-harekete geçirmek2. Öte yandan, çentik ve onun ligandlar aynı hücrede arasındaki etkileşimi çentik yolu inhibisyonu yol açar ve CISbilinmektedir-inhibisyon3. Trans– ve BDTarasındaki denge-etkileşimleri optimum ligand-bağımlı çentik4sinyal sağlamak için gereklidir. Drosophila vardır bir çentik reseptörü ve iki ligandlar (Delta ve Serrate) dört çentik reseptörleri ve beş ligandlar var memeliler aksine [1 (JAG1), JAG2, pürüzlü delta benzeri 1 (DLL1), DLL3 ve DLL4]5. Bu basitlik sahip, Drosophila model çentik-ligand etkileşimleri ve daha sonra üzerinde çentik sinyal yolu değiştirici etkilerini incelemek/çalışma için kolaylığı sağlar. (Kanat geliştirme Drosophiladahil olmak üzere), hayvan gelişimi sırasında belirli bağlamlarda CIS– ve trans-etkileşimleri çentik uygun sinyal elde etmek ve kader1,6 hücre için söz konusu . BDTtranskarşı çentik yolu değiştiriciler Bu içeriklerde etkilerini ayırt etmek önemlidir-çentik etkileşimleri ile onun ligandlar.

Bizim grup daha önce ksiloz Drosophila çentik için olumsuz olarak adlandırılan bir karbonhidrat kalıntı ilavesi çentik kanat geliştirme7de dahil olmak üzere belirli bağlamlarda sinyal düzenleyen bildirdi. Şems kaybı (enzim o xylosylates çentik) için bir “kayıp kanat damarın” fenotip7açar. Daha yakın zamanlarda, gen dozaj deneyler ve klonal analiz shams kaybı Delta-aracılı çentik singling geliştirir göstermek için kullanılmıştır. Gelişmiş çentik shams mutantlar sinyal azalmış CISbir sonucu olup ayırt etmek için-inhibisyon veya artmış trans-harekete geçirmek, içinde larva kanat Imaginal diskler ligandlar çentik Ektopik overexpression çalışmaları dpp-GAL4 sürücüyü kullanarak uygulandı. Bu deneyler Shams transdüzenleyen kanıt düşündüren sağlanan-harekete geçirmek-in Delta tarafından çentik çentik CISetkilemeden-inhibisyon ligandlar8tarafından. Ancak, düzenlemeler geri besleme ve endojen ligandlar etkileri Ektopik overexpression çalışmalar1,6,9yorumu karmaşık.

Drosophila S2 hücreleri10 kullanıldı, bu sorunu gidermek için hangi çentik-ligand etkileşim çalışmaları11,12için basit vitro sistem sağlamak. S2 hücreleri değil endojen çentik reseptör ve Delta ligand11 hızlı ve çentik-ligand toplama deneyler8etkilemez Serrate13, düşük düzeyde ifade eder. Bu nedenle, S2 hücreleri stabil veya geçici çentik ve/veya bireysel ligandlar (Delta veya Serrate) sadece çentik reseptör veya onun ligandlar biri hızlı hücre oluşturmak için veya bunların bir kombinasyon tarafından transfected. Çentik ifade S2 hücrelerinin ligand ifade S2 hücreleri sonuçlarında heterotypic toplamları Reseptör-ligand bağlayıcı11,12,14tarafından aracılı oluşumu ile karıştırma. Miktar toplam oluşumu sağlar bir ölçüsü trans-çentik ve onun ligandlar15 (şekil 1) bağlama. Benzer şekilde, S2 hücreler çentik ve Delta veya Serrate ligandlar ile ortak transfected olabilir (Yani CIS-ligandlar). BDT-bu çentik ifade S2 hücrelerde ligandlar iptal etmek çentik bağlama ile trans-ligandlar ve sonucu azalmıştır toplama oluşumu8,12,14. Toplama oluşumu CIStarafından neden göreli düşüş-ligandlar CISinhibitör etkisini ölçüsü sağlar-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-ligandlar (Şekil 2). Buna göre hücre toplama deneyleri xylosylation kaybı trans– ve BDTüzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır-çentik ve onun ligandlar arasındaki etkileşimler.

Burada, çentik bağlama ile transdeğerlendirmek için hücre toplama deneyleri amaçlayan için detaylı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar Drosophila S2 hücreleri kullanarak. Örnek olarak, biz bize çentik ve transarasında bağ çentik xylosylation etkisini belirlemek izin verilen veri sağlar-Delta8. Bu basit deneyleri çentik-ligand etkileşimleri vitro yarı nicel bir değerlendirme sağlar ve çentik yolu değiştiriciler vivo içinde etkileri altında yatan moleküler mekanizmalar belirlemek.

Protocol

1. Şems nakavt için çift telli RNA (dsRNA) hazırlanması PCR güçlendirme ürünleri Vahşi tipi sarı beyaz (y w) genomik DNA ve pAc5.1-EGFP dsRNA sentezinde kullanılan DNA parçalarının yükseltmek için şablon ve aşağıdaki astar çiftleri kullanın. Aşağıdaki PCR termal profili kullan: denatürasyon (95 ° C, 30 s), tavlama (58 ° C, 30 s) ve uzantı (72 ° C, 1 dk.). Yeşil flüoresan Protein gelişmiş (EGF…

Representative Results

Vivo gözlemlerimiz xylosyltransferase gen shams sonuçlarında çentik nedeniyle sinyal kazanç kaybı Delta-aracılı transartış önerdi- CISetkilemeden çentik aktivasyonu-inhibisyonu Çentik ligandlar8tarafından. Bu kavramı sınamak için vitro hücre toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, S2 hücre deyimde Şems Şems dsRNA kullanarak yere düştü. EGFP dsRNA denetim…

Discussion

Kurallı sinyal çentik çentik reseptör ve onun ligandlar5arasındaki etkileşimler bağlıdır. Çentik yolu en çalışmaları, öncelikle çentik ve ligandlar komşu hücrelere (trans) bağlama dikkate rağmen çentik ve aynı hücre ligandlar etkileşim ve bu sözde CIS-etkileşimleri çentik bir inhibitör rol oynayabilir 3,4sinyal. Buna göre kurallı çentik sinyal üzerinde bir değiştirici etkileri altında ya…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar NIH/NIGMS destek kabul (HJN R01GM084135) ve Glycoscience (hibe #110071 HJN) ve are minnettar Tom V. Lee için tartışma ve öneriler deneyleri, Mizutani Vakfı ve Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine ve Plazmidler ve hücre hatları için Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC).

Materials

BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Play Video

Cite This Article
Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

View Video