Ensayo de cambio en la corrida electroforética (EMSA)
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개요
El análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) es un procedimiento bioquímico utilizado para aclarar la unión entre proteínas y ácidos nucleicos. En este ensayo se mezclan un ácido nucleico radiomarcado y prueba de la proteína. Enlace se determina mediante electroforesis en gel que separa componentes basados en la masa, carga y conformación.
Este video muestra los conceptos de EMSA y un procedimiento general, incluyendo detección, encuadernación, electroforesis y preparación del gel y de la proteína. En este video las aplicaciones incluyen el análisis de enzimas de remodelación de la cromatina, una EMSA modificado que incorpora biontinylation y el estudio de los sitios de los reguladores de la respuesta bacteriana de Unión.
EMSA, el análisis de cambio de movilidad electroforética, también conocido como el análisis de cambio de gel, es un procedimiento bioquímico versátil y sensible. EMSA aclara unión entre proteínas y ácidos nucleicos mediante la detección de un cambio de bandas en electroforesis en gel.
Este video describe los principios de la EMSA, proporciona un procedimiento general y habla de algunas aplicaciones.
Replicación del ADN, transcripción y reparación, así como procesamiento de RNA es procesos bioquímicos todos críticos. Todos implican la unión entre proteínas y ácidos nucleicos. Muchos trastornos y enfermedades graves se asocian a modificaciones en este enlace. EMSA es una técnica para determinar cualitativamente si una proteína específica se une a un ácido nucleico específico. En primer lugar, se etiqueta el ácido nucleico, generalmente con fósforo-32 radioactivo, para crear una punta de prueba. Luego la proteína de prueba y sonda de ácido nucleico se mezclan. Cuando una proteína se une a una sonda de ácido nucleico, el complejo resultante tiene mayor masa y una conformación diferente que el ácido nucleico solo.
Una vez enlazado, los complejos se analizan con electroforesis en gel. En esta técnica, un campo eléctrico fuerza macromoléculas para migrar a través de una matriz de gel. Los componentes separan en base a masa, carga y conformación. Electroforesis puede separar complejos proteína-DNA de sondas no consolidadas. Puesto que tienen conformaciones y diferentes masas, que migran por el gel a diferentes ritmos y separar. La separación se detecta fácilmente, gracias a la presencia de fósforo radiactivo y prueba con éxito, la proteína se une al ácido nucleico determinado. Para verificar la identificación de la proteína, un “supercambio” emplea un anticuerpo con una conocida afinidad a la proteína. Esto tiene la ventaja de desplazar aún más el complejo, aumentando la resolución.
Ahora que hemos visto los principios, vamos a ver en el laboratorio.
Para comenzar el procedimiento, la proteína debe estar aislada. Para ello, se utilizan técnicas de biología molecular para expresar la proteína en las células y luego purificar.
El ácido nucleico es amplificado y etiquetado para crear una punta de prueba. Etiquetado se realiza a través de la incubación durante 10 minutos con dCTP con fósforo-32 radioactivo. Un banco de trabajo de seguridad de radiación y equipos de protección se requiere.
Luego se prepara el gel. El gel debe ser no-desnaturalizar, para evitar que la proteína alterar la conformación y potencialmente desvinculación de la sonda durante la electroforesis. Geles de poliacrilamida tienen tamaños de poro de 5 a 20 nm y son útiles para las sondas cortas hasta 100 pares de bases en longitud. Geles de agarosa tienen tamaños de poro de 70-700 nm y son útiles para las sondas más grandes.
Con la proteína y la sonda de ácido nucleico ya preparados, procedemos a atar. Se prepara una solución de tampón TRIS y se añaden la proteína y la sonda. El pH debe ser similar a las condiciones fisiológicas y concentración de la sal suficiente para impedir que la proteína formando lazos débiles con los ácidos nucleicos no objetivo. La reacción procede por 20-30 min a 4 ° C.
El siguiente paso es la electroforesis. Se utiliza un tampón de baja fuerza iónica y pH similar a la utilizada en la reacción de enlace. Produce un “efecto jaulas” que estabiliza los complejos, aumenta la movilidad y reduce la generación de calor. Después de la electroforesis, los componentes del gel se transfieren a papel de filtro. En un cuarto oscuro, el papel de filtro luego se expone a la película. Si la proteína se une a la sonda, dos regiones diferentes de etiquetado será visibles en la transferencia. Que representa el complejo y aparte una que representa la punta de prueba independiente. La separación demuestra que la proteína unida con éxito para el ácido nucleico.
Ahora que hemos visto lo básico, vamos a ver algunas aplicaciones.
La cromatina es el complejo firmemente lleno de ADN y proteínas que se encuentran las células eucariotas. Remodelación de cromatina enzimas modifican la estructura para abrir la DNA transcripción. Como esto cambia la movilidad del complejo, EMSA puede utilizarse para explorar la actividad de la enzima.
Un enfoque alternativo para etiquetado toma ventaja de la interacción entre la DNA y la enzima metiltransferasa. Un cofactor puede ser modificado para enlazar permanentemente a la DNA vía metiltransferasa. En lugar de etiquetar con fósforo-32, el cofactor es conjugado con biotina, que es ventajoso ya que no es radiactivo. Porque el cofactor es específico en su fijación, es relevante para la genotipificación y detección de metilación genes. Los biotinilated los ácidos nucleicos son detectados a través de fluorescencia ULTRAVIOLETA.
Cuando estímulos ambientales activan cinasas de la histidina, se fosforila un “regulador de respuesta”. Esto a su vez se une al DNA, que afectan a la transcripción, que puede ser estudiada por EMSA. Por ejemplo, un regulador de respuesta de Desulfovibrio vulgaris fue demostrado para enlazar con el gen de interés. EMSA se utilizó para verificar que el enlace tuvo lugar.
Sólo ha visto video en lo análisis de cambio de movilidad electroforética de Zeus. Ahora debe comprender sus principios de operación, los pasos de su procedimiento y sus principales parámetros de funcionamiento.
¡Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
내레이션 대본
EMSA, the electrophoretic mobility shift assay, also known as the gel shift assay, is a versatile and sensitive biochemical procedure. EMSA elucidates binding between proteins and nucleic acids by detecting a shift in bands in gel electrophoresis.
This video describes the principles of EMSA, provides a general procedure, and discusses some applications.
DNA replication, transcription, and repair, as well as RNA processing are all critical biochemical processes. They all involve binding between proteins and nucleic acids. Many serious diseases and disorders are associated with modifications in this binding. EMSA is a technique for qualitatively determining whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled, usually with radioactive phosphorus-32, to create a probe. Then the test protein and nucleic acid probe are mixed. When a protein binds to a nucleic acid probe, the resulting complex has greater mass and a different conformation than the nucleic acid alone.
Once bound, the complexes are analyzed with gel electrophoresis. In this technique, an electric field forces macromolecules to migrate through a gel matrix. The components separate based on mass, charge, and conformation. Electrophoresis can separate protein-DNA complexes from unbound probes. Since they have different masses and conformations, they will migrate through the gel at different rates and separate. The separation is easily detected, thanks to the presence of the radioactive phosphorus, and proves the protein successfully binds to the given nucleic acid. To verify the identification of the protein, a “supershift assay” uses an antibody with a known affinity to the protein. This has the added benefit of further shifting the complex, increasing resolution.
Now that we’ve seen the principles, let’s see it in the lab.
To begin the procedure, the protein must be isolated. To do this, molecular biology techniques are used to express the protein in cells, and then purify.
The nucleic acid is amplified and labeled to create a probe. Labeling is done through incubation for 10 min with dCTP containing radioactive phosphorus-32. A radiation-safe workbench and protective equipment are required.
The gel is then prepared. The gel needs to be non-denaturing, to prevent the protein from altering conformation and potentially unbinding from the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of 5 to 20 nm and are useful for short probes up to 100 base pairs in length. Agarose gels have pore sizes of 70-700 nm and are useful for larger probes.
With the protein and nucleic acid probe now prepared, we proceed to binding. A TRIS buffer solution is prepared and the protein and probe are added. The pH should be similar to physiological conditions, and salt concentration sufficient to prevent the protein from forming weak bonds with non-target nucleic acids. The reaction proceeds for 20-30 min at 4 °C.
The next step is electrophoresis. A buffer of low ionic strength and a pH similar to that used in the binding reaction is utilized. It yields a “caging effect” that stabilizes complexes, increases mobility, and reduces heat generation. After electrophoresis, the components of the gel are transferred onto filter paper. In a dark room, the filter paper is then exposed to film. If the protein binds to the probe, two distinct labeled regions will be visible in the transfer. One representing the complex, and a separate one representing the unbound probe. The separation demonstrates that the protein successfully bound to the nucleic acid.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
Chromatin is the tightly packed complex of DNA and proteins found eukaryotic cells. Chromatin-remodeling enzymes modify the structure to open the DNA to transcription. As this changes the mobility of the complex, EMSA can be used to explore the binding activity of the enzyme.
An alternate approach to labeling takes advantage of the interaction between DNA and the methyltransferase enzyme. A cofactor can be modified to bind permanently to DNA via methyltransferase. Rather than labeling with phosphorus-32, the cofactor is conjugated to biotin, which is advantageous because it’s not radioactive. Because the cofactor is site-specific in its attachment, it’s relevant to genotyping, methylation detection, and gene delivery. The biotinilated nucleic acids are detected through ultraviolet fluorescence.
When environmental stimuli activate histidine kinases, a “response regulator” is phosphorylated. This in turn binds to DNA, affecting transcription, which can be studied by EMSA. For instance, a response regulator in Desulfovibrio vulgaris was demonstrated to bind to the gene of interest. EMSA was used to verify that the binding took place.
You’ve just watched JoVE’s video on the electrophoretic mobility shift assay. You should now understand its principles of operation, the steps in its procedure, and its major operating parameters.
Thanks for watching!
