JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

Abstract

קביעת המבנה באורך מלא של ריבוזום הרכבה גורם Nsa1 של האפייה (cerevisiae ס) הוא מאתגר בגלל סדר, פרוטאז יציב קרבוקסילי של החלבון. כתב יד זה מתאר את השיטות לטיהור Nsa1 רקומביננטי של cerevisiae ס עבור ניתוח מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והן SAXS. קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היה מנוצל כדי לפתור את המבנה של המחשבים N-מסוף WD40 ומסודרת של Nsa1 ולאחר מכן SAXS שימש כדי לפתור את המבנה של C-הסופית של Nsa1 בתמיסה. פתרון פיזור הנתונים נאספו מ- Nsa1 באורך מלא בתמיסה. Amplitudes פיזור תיאורטי חושבו מתוך מבנה הגביש ברזולוציה גבוהה של התחום WD40 ולאחר מכן שילוב של גוף קשיח ומודלים ab initio חשף את קצה קרבוקסילי של Nsa1. באמצעות גישה זו היברידית שוחזר המבנה רבעוני של החלבון כולו. השיטות המובאות כאן צריך להיות חלים באופן כללי מצפני היברידית מבניים לחלבונים אחרים מורכבת תערובת של תחומים מובנים ולא מובנים.

Introduction

הריבוזומים הם מכונות ribonucleoprotein גדול לבצע את התפקיד החיוני של mRNA לתרגם חלבונים בתאים חיים לכל. הריבוזומים מורכבים subunits שני המיוצרים בתהליך מורכב כינה ריבוזום להן1,2,3,4. ריבוזום האיקריוטים הרכבה מסתמך על הסיוע של מאות הרכבה ribosomal חיוני גורמים2,3,5. Nsa1 (Nop7 הקשורים 1) הוא גורם הרכבה ריבוזום האיקריוטים נדרשת במיוחד עבור ההפקה של יחידת משנה ribosomal גדול6, הוא ידוע כ/כפי WD-חזור המכילה 74 (WDR74) באורגניזמים גבוה7. WDR74 הוכח הדרושות הבלסטוציסט היווצרות עכברים8, יזם WDR74 הוא לעתים קרובות מוטציה בתאי סרטן9. עם זאת, תפקוד ואת מנגנוני מדויק של Nsa1/WDR74 בהרכבה ריבוזום הם עדיין אינו מודע לקיומם. כדי להתחיל לחשוף את התפקיד של Nsa1/WDR74 במהלך ההבשלה האיקריוטים ריבוזום, בוצעו מספר ניתוחים מבניים, לרבות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, זווית קטנה רנטגן פיזור (SAXS)10.

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, מיקרוסקופ אלקטרוני, ו SAXS הם כולם חשובים טכניקות לימוד מבנה macromolecular. גודל, צורה, זמינות, יציבות של מקרומולקולות השפעות שיטת ביולוגיה מבנית אשר מקרומולקולה מסוים יהיה עדיף מתאים, אולם שילוב טכניקות מרובות באמצעות גישה כביכול “היברידי” הופכת כלי מועיל יותר ויותר11. בפרט קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- SAXS הם חזקים משלימים שיטות לקביעת מבנית של מקרומולקולות12.

קריסטלוגרפיה מספק הבראבה ברזולוציה גבוהה, מולקולות קטנות ועד מכונות הסלולר גדול כגון הריבוזום, הוביל לפריצות רבות בהבנה של פונקציות ביולוגיות של חלבונים ועוד מקרומולקולות13. יתר על כן, תכנון תרופות מבוססות-מבנה רתמות הכוח של קריסטל מבנים עבור עגינה מולקולרית על ידי שיטות חישובית, הוספת ממד ביקורתי סמים בגילוי ופיתוח14. למרות את תחולתן רחבה, מערכות גמיש ומבולבלת הן מאתגרות כדי להעריך על-ידי קריסטלוגרפיה מאז קריסטל האריזה יכול להיות יופרע או מפות צפיפות אלקטרונים עשוי להיות חלקי או באיכות ירודה. לעומת זאת, SAXS היא פתרון ומבוססי ברזולוציה נמוכה מבניים גישה מסוגל לתאר את מערכות גמיש החל לולאות המתוסבכים טרמיני חלבונים ממהותם המתוסבכים12,15,16. בהתחשב שהוא תואם למגוון רחב של חלקיקים גדלים12, SAXS יכולות לפעול בסינרגיה עם קריסטלוגרפיה כדי להרחיב את טווח השאלות הביולוגיות זה ניתן לטפל על ידי מחקרים מבנית.

Nsa1 מתאים לגישה המבנית היברידית מכיוון שהוא מכיל תחום WD40 בנוי היטב ואחריו פונקציונלי, אך גמיש קרבוקסילי אשר אינה נוטה שיטות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הבא הוא פרוטוקול עבור שכפול, ביטוי, טיהור של cerevisiae ס Nsa1 לקביעת מבנה היברידי על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, SAXS. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד את מבנה של חלבונים אחרים המורכב מעובדים בשילוב של אזורים מסודרת ומבולבלת.

Protocol

1. ייצור חלבון רקומביננטי ולטיהור אס 1 Nsa1 ביטוי פלסמיד עיצוב, שיבוט לקבל או לרכוש DNA גנומי cerevisiae ס . PCR להגביר את רצפי היעד של Nsa1 (Nsa1חליל, שאריות 1-463) ו- C-מסוף נחתך Nsa1 (Nsa1ΔC, שאריות 1-434) עם תחל המתאים באמצעות DNA גנומי מבודד cerevisiae ס ו טמפרטורת ההיתוך של כ 60 ° C עם מ?…

Representative Results

Nsa1 היה PCR מוגבר מ- DNA גנומי cerevisiae ס ו subcloned לתוך וקטור המכיל תג קירבה x 6-היסטידין N-מסוף ואחריו MBP, אתר פרוטאז ‘ אס ‘. Nsa1 הפך לתוך e. coli BL21(DE3) כדוריות, תפוקה גבוהה של חלבון ביטוי התקבלו בעקבות אינדוקציה עם IPTG וצמיחה 25 ° c בלילה (איור 1 א’). Nsa1 הייתה זיקה-מטוהר?…

Discussion

באמצעות פרוטוקול זה, Nsa1 רקומביננטי של cerevisiae ס נוצר ללימודי מבניים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והן SAXS. Nsa1 ומנומסת בתמיסה, גיבש בצורות קריסטל מרובים. במהלך אופטימיזציה של גבישים אלו, התגלה כי קצה קרבוקסילי של Nsa1 היה רגיש פרוטאז השפלה. הרזולוציה הגבוהה, טופס הגבישית האורתורומ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עקיפה הנתונים נאספו ב דרום מזרח אזוריים שיתופי גישה צוות (SER-חתול) 22-ID ו- 22-מוניטור beamlines-מתקדם הפוטון מקור (APS), Argonne National Laboratory. הנתונים SAXS נאספו על הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS-מראש אור מקור (ALS), המעבדה הלאומית לורנס ברקלי. ברצוננו להודות לצוות-הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS על עזרתם עם איסוף נתונים מרחוק ועיבוד. אנחנו אסירי תודה הלאומית המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) מסה ספקטרומטר המחקר, קבוצת תמיכה כדי לברר את גבולות התחום חלבון עבודה זו נתמכה על ידי לנו מכון של בריאות מגזר מחקר התכנית הלאומית; המכון הלאומי האמריקאי למדעי בריאות וסביבה (NIEHS) (ZIA ES103247 ל ר א ס) ומכונים הקנדית לחקר בריאות (CIHR, 146626 כדי M.C.P). השימוש APS נתמכה על ידי לנו משרד האנרגיה, משרד המדע, משרד בסיסי אנרגיה למדעים תחת חוזה מס W-31-109-Eng-38. שימוש של מקור אור מתקדם (ALS) נתמכה על ידי מנהל, משרד המדע, משרד בסיסי אנרגיה למדעים, של מחלקת האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה מס דה-AC02-05CH11231. תמיכה נוספת עבור הפרעות לקרן החלקיקים SIBYLS SAXS נובע המכון הלאומי לבריאות פרוייקט מינוס (R01GM105404), יוקרתי מכשור גראנט S10OD018483. כן נרצה להודות אנדריאה הירח ואת ד ר שרה אנדרס. בקריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

X-ray CrystallographySmall Angle X-ray Scattering (SAXS)Structural AnalysisProtein StructureRecombinant ProteinUnstructured RegionsNsa1S. CerevisiaeHybrid Structural AnalysisProtein FunctionProtein DynamicsProtein AggregationPurificationAffinity ChromatographyGel FiltrationSDS-PAGETEV ProteaseCentrifugal Filtration
check_url/kr/56953?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image