JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Denne metoden beskriver kloning, uttrykk og rensing av rekombinant Nsa1 for strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS) og gjelder for hybrid strukturell analyse av andre proteiner som inneholder begge bestilte og uordnede domener.

Abstract

Fastsettelse av full lengde ribosom montering faktor Nsa1 fra Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er utfordrende på grunn av den uordnede og protease labil C-terminus av protein. Dette manuskriptet beskriver metodene for å rense rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturell analyse av både Røntgenkrystallografi og SAXS. Røntgenkrystallografi ble benyttet for å løse strukturen i velordnet N-terminal WD40 domenet Nsa1, og deretter SAXS ble brukt til å løse strukturen i C-terminus av Nsa1 i løsningen. Løsning spredning data var samlet inn fra full lengde Nsa1 i løsningen. De teoretiske spredning amplituder ble beregnet fra den høyoppløselige krystallstruktur WD40 domenet, og deretter en kombinasjon av rigid kropp og ab initio modellering avslørt C-terminus av Nsa1. Gjennom denne hybrid rekonstruert kvartær strukturen av hele protein. Metodene presenteres her skal generelt gjelder for hybrid strukturelle fastsettelse av andre proteiner som består av en blanding av strukturert og ustrukturert domener.

Introduction

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner som utfører den viktige rollen oversette mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomer består av to underenheter som produseres i en kompleks prosess kalt ribosom, biogenesis,1,,2,,3,,4. Eukaryote ribosom montering avhengig ved hjelp av hundrevis av viktige ribosomal montering faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tilknyttet 1) er en eukaryote ribosom montering faktor som er spesielt nødvendig for produksjon av store ribosomal delenhet6, og er kjent som WD-gjenta inneholder 74 (WDR74) i høyere organismer7. WDR74 har vist seg å være nødvendig for blastocysten formasjonen i mus8og WDR74 selskapet er ofte mutert i kreft celler9. Funksjonen og presis mekanismer for Nsa1/WDR74 i ribosom samling er imidlertid fortsatt hovedsakelig ubekjent. For å begynne å avdekke rollen som Nsa1/WDR74 under eukaryote ribosom modning, ble flere strukturelle analyser utført, inkludert Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS)10.

Røntgenkrystallografi, kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, elektronmikroskop og SAXS er alle viktige teknikker for å studere macromolecular struktur. Størrelse, form, tilgjengelighet og stabilitet av makromolekyler påvirkninger metoden strukturell biologi som en bestemt Makromolekyl vil være best egnet, men kombinerer flere teknikker gjennom en såkalt “hybrid” tilnærming blir en stadig verktøy11. Spesielt er Røntgenkrystallografi og SAXS kraftig og utfyllende metoder for strukturelle besluttsomhet makromolekyler12.

Krystallografi gir høy oppløsning atomic strukturer spenner fra små molekyler til store cellulære maskiner som ribosomet, og har ført til mange gjennombrudd i forståelsen av biologiske funksjoner av proteiner og andre makromolekyler13. Videre utnytter strukturen-baserte narkotika design kraften i crystal strukturer for molekylær dokking ved beregningsorientert metoder, legge en kritisk dimensjon til narkotika og utvikling14. Til tross for anvendelse sin brede er fleksible og uordnede systemer utfordrende å vurdere krystallografi siden krystall pakking kan bli hindret eller electron tetthet kart kan være ufullstendig eller av dårlig kvalitet. Derimot er SAXS en løsning-baserte og lav strukturelle tilnærming kan beskrive fleksibel systemer spenner fra uordnede looper og termini egentlig uordnede proteiner12,15,16. Vurderer den er kompatibel med et bredt spekter av partikkel størrelser12, kan SAXS arbeide synergi med krystallografi å utvide utvalget av biologisk spørsmål som kan løses av strukturelle studier.

Nsa1 er egnet for en hybrid strukturelle tilnærming fordi den inneholder en velstrukturert WD40 domenet etterfulgt av en funksjonell, men fleksible C-terminus som ikke er mottakelig for Røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokoll for kloning, uttrykk og rensing av S. cerevisiae Nsa1 for hybrid strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og SAXS. Denne protokollen kan tilpasses for å studere strukturer av andre proteiner som består av en kombinasjon av bestilte og uordnede.

Protocol

1. rekombinant Protein produksjon og rensing av Nsa 1 Nsa1 uttrykk plasmider Design og kloning Få eller kjøpe S. cerevisiae genomisk DNA. PCR forsterke målet sekvenser av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) og C-terminalen avkuttet Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med riktig primer bruker genomisk DNA isolert fra S. cerevisiae og en Smeltetemperaturen for ca 60 ° C med en utvidelse tid på 1-2 min. Følgende primerne ble brukt til å forsterke Nsa1:SC_Nsa1_…

Representative Results

Nsa1 var PCR forsterket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor inneholder en N-terminal 6 x-histidin affinitet kode etterfulgt av MBP og en TEV protease nettsted. Nsa1 ble forvandlet til E. coli BL21(DE3) celler og høy avkastning av protein uttrykk ble innhentet etter induksjon med IPTG og vekst ved 25 ° C over natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renset på immobilisert kobolt affinitet harpiks, etterfulgt av MBP spaltin…

Discussion

Bruker denne protokollen, ble rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae generert for strukturelle studier både Røntgenkrystallografi og SAXS. Nsa1 var godt opptrådt i løsningen og krystallisert i flere krystall skjemaer. Under optimalisering av disse krystallene, ble det oppdaget at C-terminus av Nsa1 var følsom for protease degradering. Høy oppløsning, orthorhombic krystall skjemaet kunne bare dupliseres med C-terminalen trunkering varianter av Nsa1, sannsynligvis fordi fleksibel C-terminus av Nsa1 forhindret k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diffraksjon dataene ble samlet på Sørøst regionalt samarbeid tilgang Team (SER-CAT) 22-ID og 22-BM beamlines på Avansert Foton kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXS dataene ble samlet inn på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi ønsker å takke ansatte på SIBYLS beamline for deres hjelp med eksterne innsamling og prosessering. Vi er takknemlige til National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjelp avgjøre domenegrenser protein. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institute for Health Intramural forskningsprogram; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de kanadiske instituttene of Health Research (CIHR, 146626 til M.C.P). Bruk av APS ble støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office for energi basalfag under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Bruk av avansert lys kilde (ALS) ble støttet av direktør, Office of Science, Office for energi basalfag, av US Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Ekstra støtte for SIBYLS SAXS beamline kommer fra National Institute of Health prosjektet MINOS (R01GM105404) og et avansert instrumentering Grant S10OD018483. Vi vil også gjerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritisk lesning av dette manuskriptet.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

X-ray CrystallographySmall Angle X-ray Scattering (SAXS)Structural AnalysisProtein StructureRecombinant ProteinUnstructured RegionsNsa1S. CerevisiaeHybrid Structural AnalysisProtein FunctionProtein DynamicsProtein AggregationPurificationAffinity ChromatographyGel FiltrationSDS-PAGETEV ProteaseCentrifugal Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image