माउस रेटिना वर्णक उपकला से प्राथमिक सेल संस्कृतियों
Summary
रेटिना वर्णक उपकला (RPE) आँख का एक बहु-कार्यात्मक उपकला है. यहां हम प्राथमिक कोशिका murine RPE से व्युत्पंन संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (RPE) तंत्रिका रेटिना और आँख की धमनियां के बीच स्थित है कि एक अत्यधिक ध्रुवीकरण बहु-कार्यात्मक उपकला है. यह pigmented कोशिकाओं है कि षट्कोण पैक और तंग जंक्शनों से जुड़े रहे हैं की एक एकल पत्रक है । RPE के मुख्य कार्य प्रकाश का अवशोषण शामिल हैं, शेड के phagocytosis photoreceptor बाहरी क्षेत्रों, आयनों के स्थानिक बफ़रिंग, पोषक तत्वों, आयनों और पानी के परिवहन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दृश्य चक्र में सक्रिय भागीदारी. इस तरह के महत्वपूर्ण और विविध कार्यों के साथ, यह गंभीर रूप से RPE कोशिकाओं के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । RPE सेल लाइनों की एक संख्या स्थापित किया गया है; हालांकि, पारित और अमर कोशिकाओं को जल्दी से प्राकृतिक RPE कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक विशेषताओं में से कुछ खोने के लिए जाना जाता है । इस प्रकार, प्राथमिक कोशिकाओं RPE सेल जीवविज्ञान और समारोह के विभिंन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए और अधिक उपयुक्त हैं । माउस प्राथमिक RPE सेल संस्कृति शोधकर्ताओं के लिए बहुत उपयोगी है के बाद से माउस मॉडल व्यापक रूप से जैविक अध्ययन में उपयोग किया जाता है, लेकिन माउस से RPE कोशिकाओं का संग्रह भी बहुत उनके छोटे आकार के कारण चुनौतीपूर्ण है । यहां, हम प्राथमिक माउस RPE सेल संस्कृतियों जो enucleation और आंखों और RPE शीट के अलगाव के संवर्धन के लिए कोशिकाओं को उपज शामिल है की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । इस विधि कुशल सेल वसूली सक्षम बनाता है । दो चूहों से प्राप्त RPE कोशिकाओं १ १२ मिमी पॉलिएस्टर झिल्ली पर प्रवाह में पहुंच सकते हैं संस्कृति के एक सप्ताह के बाद संस्कृति प्लेट में पूर्व लोड डालने और दो के बाद इस तरह के षट्कोण आकार और रंजकता के रूप में बोनाी RPE कोशिकाओं के मूल गुण के कुछ प्रदर्शन संस्कृति के सप्ताह ।
Introduction
रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के तंत्रिका रेटिना और आँख की धमनियां के बीच स्थित है कि ध्रुवीकरण उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत है. RPE कोशिकाओं की कार्यक्षमता और RPE monolayer की अखंडता दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि RPE कई प्रक्रियाओं में एक प्रमुख भूमिका निभाता है जैसे बाहरी रक्त रेटिना बाधा, पानी और रेटिना और आयनों के बीच परिवहन को बनाए रखने के रूप में रंजित, प्रकाश अवशोषण, ऑक्सीडेटिव तनाव से संरक्षण, रेटिनॉइड चयापचय के नियंत्रण, और photoreceptors के बाहरी क्षेत्रों के phagocytosis1,2. आंखों के पीछे RPE के स्थान, साथ ही साथ अपनी बाधा समारोह को रोकने दवाओं अवलेह हास्य को रक्त से गुजर से प्रणालीबद्ध प्रशासित, यह मुश्किल vivo मेंRPE समारोह की जटिलता का अध्ययन करने के लिए करते हैं । इस प्रकार, एक लचीला, नियंत्रित पर्यावरण3,4में RPE कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए RPE सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक बड़ी जरूरत है ।
स्थापित RPE सेल लाइनों के एक नंबर मौजूद हैं, प्राप्त करने और कोशिकाओं को भंडारण का एक आसान और सुविधाजनक तरीका प्रदान; हालांकि, मार्गीय कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं2,3,4की तुलना में कुछ नुकसान है । सबसे पहले, वे अक्सर कक्ष आकृति विज्ञान में परिवर्तन की विशेषता है । उदाहरण के लिए, मौजूदा सेल लाइनों में से कोई भी सेल ध्रुवीकरण phenotype और तंग जंक्शनों के आंशिक गायब होने के नुकसान के कारण RPE बाधा संपत्तियों के एक विश्वसनीय अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं पाए गए4। ध्रुवीकरण और उचित सेल-टू-सेल कनेक्शन के नुकसान के अलावा, RPE सेल लाइनों जल्दी से वयस्क RPE में कुंजी melanogenesis एंजाइमों के अभाव के कारण उनके रंजकता खो5। रंजकता बहाल किया जा सकता है, लेकिन पुनः के तंत्र के व्यापक विश्लेषण-रंजकता जो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और रासायनिक परख के लिए मेलेनिन की उपस्थिति की पुष्टि शामिल होगा कभी नहीं 6प्रदर्शन किया गया । एक और सीमा है कि RPE सेल लाइनों सेल जीवन बढ़ाया है (कभी-अमरता) और कुछ शर्तों के तहत स्वयं में बदल सकते है multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि सब्सट्रेट और फार्म फ्लोटिंग कालोनियों से अलग है7-नवीकरण, 8. यह सीमा प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए असंभव बना देता है3.
स्थापित RPE सेल लाइनों के नुकसान को ध्यान में रखते हुए, प्राथमिक RPE कोशिका संस्कृतियों ताजा ऊतकों से प्राप्त एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा के लिए RPE का अध्ययन कर सकते हैं । प्राथमिक RPE कोशिकाओं न केवल विटामिन ए चयापचय के रूप में RPE-विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है9, photoreceptor बाहरी क्षेत्रों की10 और आयन परिवहन11, लेकिन यह भी उपकला जैसे बुनियादी कोशिका जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए phagocytosis सेल ध्रुवीयता2 , lysosomal homeostasis, और autophagy12,13।
पिछले कुछ वर्षों में वहां प्राथमिक RPE संस्कृतियों की स्थापना पर प्रकाशनों के एक नंबर रहे हैं, अनुसंधान के इस क्षेत्र में एक बढ़ती रुचि का संकेत है3,14,15। मानव RPE कोशिकाओं और गोजातीय और सुअर का RPE कोशिकाओं के रूप में गैर मानव RPE कोशिकाओं के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए थे 16, 17, 18, 19. हालांकि, यह उनके बहुत छोटे आकार के कारण माउस RPE कक्षों को हैंडल करने के लिए अधिक कठिन है । हालांकि प्रकाशनों की काफी संख्या के लिए माउस14,20,21से RPE कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, वहां अभी भी कई के बिना RPE कोशिकाओं को अलग करने के लिए संघर्ष कर रहे है शोधकर्ताओं रंजित कोशिकाओं या तंत्रिका रेटिना मलबे से कोशिकाओं की संदूषण । यहां हम प्राथमिक माउस RPE सेल संस्कृति की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान, माउस से आंखें प्राप्त करने, आंखों के विच्छेदन और RPE शीट के अलगाव के लिए संवर्धन के लिए कोशिकाओं उपज शामिल है । इस वीडियो प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो माउस प्राथमिक RPE संस्कृतियों के साथ काम शुरू कर रहे है और विच्छेदन तकनीक पर मार्गदर्शन की जरूरत के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत विस्तृत प्रोटोकॉल माउस प्राथमिक RPE संस्कृतियों की विश्वसनीय स्थापना है कि 1 सप्ताह के बाद प्रवाह तक पहुंचने और 2 सप्ताह के बाद षट्कोण आकार और रंजकता के रूप में मुख्य RPE विशेषताओं वर्तमान सक्षम ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में आंशिक रूप से BrightFocus फाउंडेशन (डी एस) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
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