Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri
Summary
Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.
Abstract
Retina pigment epiteli (RPE) sinir retina ve koroid göz arasında yer alan bir çok polarize çok fonksiyonlu epitel var. Hexagonally Paketli ve sıkı kavşaklar tarafından bağlı Pigmentli hücreleri tek bir sayfadır. RPE ana işlevleri ışık, fagositoz döken photoreceptor dış segmentleri, kayma iyonları tampon, besin, iyonlar ve su yanı sıra aktif katılımı taşımacılığının emilimini görsel döngüsünde içerir. Böyle önemli ve çeşitli fonksiyonları ile biyoloji RPE hücrelerinin çalışma kritik önemlidir. RPE hücre satır sayısını kurduk; Ancak, bazı morfolojik ve fizyolojik özellikleri doğal RPE hücrelerinin hızla kaybetmeye pasajlı ve ölümsüzleştirdi hücreler denir. Böylece, Primer hücre RPE hücre biyolojisi ve işlev farklı yönlerini eğitim için daha uygundur. Fare modelleri biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanıldığından fare birincil RPE hücre kültürü araştırmacılar için çok yararlı, ancak RPE toplama fare hücreleri de kendi küçük boyutu nedeniyle çok zor. Burada, enükleasyon ve gözleri diseksiyon ve yalıtım RPE yaprak hücre kültürü çalışmalarının için verim içeren birincil fare RPE hücre kültürleri kurmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem etkili hücre kurtarma sağlar. İki fare elde RPE hücrelerinin kültür tabağına sonra kültür ve bazı iyi niyetli RPE orijinal özelliklerini hücreleri altıgen şekil ve pigmentasyon iki sonra gibi görünen bir hafta önceden yüklenmiş bir 12 mm polyester membran Ekle confluency ulaşabilirsiniz Kültür Haftası.
Introduction
Retina pigment epiteli (RPE) sinir retina ve koroid göz arasında yer alan tek bir katman polarize epitel hücresi var. RPE hücrelerinin işlevsellik ve RPE monolayer bütünlüğünü vizyon için kritik çünkü RPE dış kan-retina bariyeri, taşıma su ve retina arasında iyonları bakımı gibi birden çok işlem önemli bir rol oynar ve Choroid, ışık emilimi, oksidatif stres, retinoid metabolizma kontrolünü ve fagositoz photoreceptors1,2dış segmentleri koruma. RPE göz gibi sistemik kan üzerinden geçişine Vitre mizah yönetilmektedir uyuşturucu önleme bariyer fonksiyonu arkasında konumunu RPE işlev içinde vivokarmaşıklığı çalışmaya zor yapmak. Böylece, esnek, kontrollü bir ortamda3,4RPE hücrelerinde çalışmaya RPE hücre kültürleri kurulması için büyük bir ihtiyaç vardır.
Kolay ve rahat bir şekilde elde etmek ve hücre depolama sağlayan birkaç kurulan RPE hücre satır yok; Ancak, pasajlı hücreleri Primer hücre2,3,4‘ e göre bazı dezavantajları var. İlk olarak, onlar kez hücre morfolojisi değişimler ile karakterizedir. Örneğin, varolan hücre hatlarda RPE bariyer özellikleri hücre polarite fenotip kaybı ve sıkı kavşak4kısmi kaybolması nedeniyle, güvenilir bir çalışma için uygun bulunmuştur. Polarite ve uygun hücre hücre bağlantıları kaybı ek olarak, RPE hücre satırlarını hızlı bir şekilde olmaması nedeniyle kendi pigmentasyon yetişkin RPE5anahtar melanogenesis enzimlerin kaybetmek. Pigmentasyon geri yüklenebilir, ancak iletim elektron mikroskobu bir arada içeren yeniden pigmentasyon mekanizmasının kapsamlı analiz, melanin varlığını doğrulamak için gen ifade analizi ve kimyasal deneyleri vardır asla gerçekleştirilen6oldu. Bir daha fazla sınırlama RPE hücre hatları genişletilmiş hücre yaşam (bazen – ölümsüzlük) ve belirli koşullar altında substrat ve koloniler7, yüzen formu ayırmak kendini yenileyerek multipotent kök hücre içine dönüştürebilirsiniz olması 8. bu sınırlama nakli3deneyler için hücre hatları kullanmak imkansız hale getiriyor.
Kurulan RPE hücre hatları dezavantajları göz önüne alındığında, taze dokulardan alınan birincil RPE hücre kültürleri RPE çalışmaya daha biyolojik olarak uygun bir model olarak hizmet verebilir. A vitamini metabolizma9, photoreceptor dış segmentleri10 ve iyon fagositoz11taşıma gibi sadece RPE özgü işlevleri çalışmaya, aynı zamanda temel hücre biyolojisi gibi çalışmaya birincil RPE hücrelerinin kullanıldığını epitel hücre polarite2 , lizozomal homeostazı ve autophagy12,13.
Birincil RPE kültürler oluşturma konusunda yayınlar bir dizi olmuştur yıl son çift içinde bu alanda araştırma3,14,15büyüyen bir ilgi gösteren. Yayınlanan16,insan RPE hücrelerinin ve insan olmayan RPE hücrelerinin sığır ve domuz RPE hücrelerinin gibi çok sayıda protokollerde idi17,18,19. Ancak, fare RPE hücrelerinin çok daha küçük boyutlarından dolayı işlemek daha zordur. Tamamen a sayı yayınların RPE hücrelerinin fare14,20,21yalıtmak için protokolleri tarif var olsa bile, orada hala pek çok araştırmacı RPE hücrelerinin olmadan yalıtmak için mücadele kirlenme choroid hücre veya hücreler nöral retina enkaz üzerinden. Burada birincil fare RPE hücre kültürü, gözleri elde etme fare, gözleri diseksiyon ve yalıtım hücre kültürü çalışmalarının için vermeye RPE sayfaların dahil kurmak için iletişim kuralı mevcut. Bu video protokol fare birincil RPE kültürleri ile çalışmak ve diseksiyon teknikleri konusunda yardıma gereksinim başlayan araştırmacılar için özellikle yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültürlerin confluency 1 hafta sonra ulaşmak ve altıgen şekil ve pigmentasyon 2 hafta sonra ana RPE niteliklerinden fare birincil RPE güvenilir kuruluş sunulan ayrıntılı iletişim kuralı sağlar. Elde edilen RPE hücrelerinin aşağı akım kullanma öyle aynı derecede A vitamini metabolizma9, photoreceptor dış segmentleri10 fagositoz ve iyon taşıma11, epitel hücre polarite2, lizozomal bir dizi için kullanıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kısmen (DS için) BrightFocus Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
