Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки
Summary
Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС)-это многофункциональный эпителия глаза. Здесь мы представляем протокол для создания начальных клеточных культур, полученных из мышиных ПЭС.
Abstract
Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является крайне поляризованную многофункциональный эпителия, который расположен между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Это один лист пигментных клеток, которые гексагонально упакованы и связаны плотные соединения. Основные функции НПП включают поглощение света, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных сарай, пространственной буферизации ионов, транспорт питательных веществ, ионов и воды, а также активное участие в круговороте визуального. С такие важные и разнообразные функции критически важно для изучения биологии клетки ПЭС. Был создан ряд НПП клеточных линий; Однако пассированный и увековечен клетки известны быстро потерять некоторые Морфологические и физиологические характеристики естественных клеток ПЭС. Таким образом Главные ячейки являются более подходящими для изучения различных аспектов НПП клеточной биологии и функции. Мышь первичной культуре клеток ПЭС является очень полезным для исследователей, поскольку мышь модели широко используются в биологических исследованиях, однако сбор НПП клетки мыши также является очень сложным из-за их малого размера. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточных культур, который включает Энуклеация и рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот метод позволяет восстановления эффективного клеток. НПП клетки, полученные из двух мышей может достигать confluency на один 12 мм полиэстер мембраны вставьте предварительно загружаются в культуре пластины после одной недели культуры и отображения, некоторые из первоначальных свойств bona fide НПП клетки как гексагональной формы и пигментации после двух недели культуры.
Introduction
Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является один слой поляризованные эпителиальных клеток, расположенный между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Функциональность НПП клеток и целостность НПП монослоя имеют решающее значение для видения, потому что НПП играет важную роль в нескольких процессах, таких как поддержание внешний барьер кровь сетчатки, транспорта воды и ионов между сетчатки и Хориоидея, легкий поглощения, защита от окислительного стресса, контроля метаболизма ретиноидов и фагоцитоз внешних сегментов фоторецепторных клеток в1,2. Расположение НПП задней части глаза, а также ее барьерные функции предотвращения наркотиков систематически осуществляется от перехода из крови в стекловидное тело, сделать это трудно изучить сложности НПП функции в естественных условиях. Таким образом существует большая необходимость создания НПП клеточных культур для изучения НПП клетки в гибкой, управляемой среды3,4.
Существует целый ряд установленных НПП клеточных линий, обеспечивая простой и удобный способ получения и хранения клеток; Однако пассированный клетки имеют некоторые недостатки по сравнению с первичной клетки2,3,4. Во-первых они часто характеризуются изменения в морфологии клеток. Например ни один из существующих линий клетки были найдены пригодны для надежного исследование НПП барьерные свойства из-за потери фенотипа клетки полярности и частичного исчезновения плотных4. Помимо потери полярности и надлежащего соединения к ячейке НПП клеточных линий быстро теряют их пигментации из-за отсутствия ключа меланогенеза ферментов в взрослых НПП5. Пигментация может быть восстановлена, но всеобъемлющий анализ механизма повторной пигментации, который будет включать сочетание просвечивающей электронной микроскопии, выражение гена анализ и химических анализов для подтверждения наличия меланина никогда были выполненных6. Еще одно ограничение, что НПП клеточных линий у жизни расширенной клетки (иногда – бессмертие) и при определенных условиях можно превратить в самостоятельного обновления Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые отсоединить от субстрата и форму плавающей колонии7, 8. это ограничение делает невозможным использовать линии клеток для трансплантации экспериментов3.
Учитывая недостатки созданной НПП клеточных линий первичных культур клеток ПЭС, полученные из свежих тканей может служить более биологически соответствующую модель для изучения ПЭС. Основная НПП клетки были использованы не только для изучения ПЭС специальные функции, такие, как витамин А метаболизм9, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных10 и ионного транспорта11, но и для изучения основных клеточной биологии как эпителия Сотовый полярности2 , лизосомальных гомеостаза и autophagy12,13.
В последние несколько лет произошел ряд публикаций о создании первичного НПП культур указывая растущий интерес к этой области исследования3,14,15. Многочисленные протоколы для человека НПП клетки и клетки не человеческого ПЭС как говядину и свинину НПП клетки были опубликованы16,,1718,19. Однако это более трудным для обработки клеток мыши НПП из-за их гораздо меньшего размера. Даже несмотря на то, что целый ряд публикаций описал протоколы изолировать НПП клетки мыши14,20,21, есть еще многие исследователи пытаются изолировать НПП клетки без загрязнение сосудистое клетки или клетки от мусора нейронных сетчатки. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточной культуры, включая получение глаза от мыши, рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот видео-протокол будет особенно полезно для исследователей, которые начинают работать с мышь первичной НПП культур и нуждаются в руководстве по методам рассечение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлен подробный протокол обеспечивает надежное создание мышь первичной НПП культур, которые достигают confluency после 1 недели и представить основные характеристики НПП гексагональной формы и пигментации после 2 недель. Полученные клетки ПЭС может использоваться для ряда течению п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось частично BrightFocus фонд (DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
