マウス網膜色素上皮からの一次電池文化
Summary
網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.
Abstract
網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある高い偏光多機能上皮です。六角にパックされ、タイトな接合で接続されている色素細胞の単一のシートです。RPE の主な機能には、視覚サイクル ライト、小屋視細胞外側セグメントの貪食能、イオンの空間バッファリング、栄養素、イオン水と積極的な関与の輸送の吸収があります。このような重要かつ多様な機能を持つ網膜色素上皮細胞の生物学を研究する重要です。RPE 細胞の数が確立しています。しかし、すぐに自然の網膜色素上皮細胞の形態学的および生理学的な特性のいくつかを失う継代と不死化細胞が知られています。したがって、一次電池は RPE 細胞生物学と機能のさまざまな側面を勉強に適しています。マウス培養網膜色素上皮細胞は研究者に非常に有用なのでマウス モデルは、生物学研究で広く使用されて、しかしマウスから細胞の RPE の収集もその小さなサイズのために非常に挑戦です。ここでは、眼球摘出と目の郭清と培養細胞を生成する RPE シートの分離を含むプライマリ マウス網膜色素上皮細胞の培養を確立するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、効率的な細胞回復をできます。2 つのマウスから得られた網膜色素上皮細胞は文化の真正な RPE の元のプロパティのいくつかは六角形と 2 つの後の色素沈着など細胞の表示 1 週間後培養プレートにあらかじめロード 1 つ 12 mm ポリエステル膜挿入時の密度に達することができます。文化週間。
Introduction
網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある偏光上皮細胞の単一の層です。網膜色素上皮細胞の機能と網膜色素上皮の膜の整合性、ビジョンの重要な RPE 外側血液網膜関門、水と網膜の間のイオンの輸送の管理などの複数のプロセスで主要な役割を果たしているので、脈絡膜、光吸収、酸化ストレス、レチノイド代謝の制御と光受容体1,2の外側のセグメントの貪食作用から保護します。硝子体液を血液から渡すから全身投与薬を防ぐバリアー機能と同様に、目の後ろに RPE の場所で、RPE 関数は、生体内の複雑性を研究することが難しくなっています。したがって、柔軟な制御環境3,4の網膜色素上皮細胞を研究する RPE 細胞培養の確立のための大きい必要があります。
取得し、セルを格納する簡単で便利な方法を提供する確立された RPE 細胞の数が存在します。しかし、継代細胞初代培養細胞2,3,4と比較していくつかの欠点があります。まず、彼らはしばしば、細胞形態の変化によって特徴付けられます。たとえば、既存の細胞のどれも細胞極性表現型の損失とタイトな接合4の部分的な消失により網膜色素上皮のバリア性の信頼性の高い研究に適していること発見されました。極性と適切な細胞間の接続の損失に加えて網膜色素上皮細胞はすぐにアダルト RPE5キー メラニン合成酵素の不在のために色素沈着を失います。色素沈着を復元することができます、しかし、透過型電子顕微鏡の組み合わせを含んでいる再色素沈着のメカニズムの包括的な分析、メラニンの存在を確認する遺伝子表現の分析と化学試金は決して実行される6をされて。1 つ以上の制限は RPE 細胞拡張セル寿命 (時に – 不滅)、特定の条件下で基板と植民地7,をフローティング フォームからデタッチ自己更新の多能性幹細胞に変形できます。8します。 この制限は移植実験3のセルの行を使用することは不可能になります。
確立された RPE 細胞の短所を考慮して新鮮な組織から得られる主な RPE 細胞培養は RPE を勉強するより生物学的に関連するモデルとして役立つかもしれない。など基本の細胞生物学の研究にもビタミン A 代謝9、貪食受容外側セグメント10とイオンの輸送11の RPE に固有の機能を学習するだけでなく、プライマリの網膜色素上皮細胞が使用されている上皮細胞極性2 、ライソゾームの恒常性とオートファジー12,13。
RPE の初代培養の確立に関する出版物の数がずっとある年の最後のカップルで研究3,14,15のこの分野での関心の高まりを示します。人間の網膜色素上皮細胞、ウシおよびブタの網膜色素上皮細胞などの非人間の網膜色素上皮細胞の多数のプロトコルが公開された16,17,18,19。しかし、はるかに小さいサイズのためマウス網膜色素上皮細胞を処理するより困難です。なしの網膜色素上皮細胞を分離するために苦労している多くの研究者はまだにもかかわらず、出版物のかなりの数は、マウス14,20,21から網膜色素上皮細胞を分離するためのプロトコルを記述して、脈絡膜細胞または神経網膜の残骸からのセルの汚染。ここでプライマリ マウス網膜色素上皮細胞培養、マウス、目の解剖および培養細胞を生成する RPE シートの分離から目の取得などを確立するためのプロトコルを提案する.このビデオ プロトコル マウス初代 RPE 培養し解離手法に関するガイダンスを必要とし始めている者に特に有用であります。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された詳細なプロトコルは、マウス初代 RPE 培養 1 週間後の confluency に到達、六角形、2 週間後に色素沈着など主な RPE 特性の信頼性確立をできます。得られた網膜色素上皮細胞は、ビタミン A 代謝9、視細胞外側セグメント10の貪食能およびイオン輸送11、上皮細胞極性2、ライソゾームなどの下流のアプリケーション?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、部分的 (DS) に BrightFocus 財団によって賄われていた。
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
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