Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel
Summary
Netthinnens pigment epitel (RPE) er en multi-funksjonell epitel i øyet. Her presenterer vi en protokoll for å etablere primært cellekulturer fra murine RPE.
Abstract
Netthinnens pigment epitel (RPE) er et svært polarisert multifunksjonelle epitel som ligger mellom neural netthinnen og akkord av øyet. Det er ett ark pigmentert celler som er hexagonally pakket og forbundet med stramme veikryss. Hovedfunksjonene til RPE inkluderer absorpsjon av lys, fagocytose skur photoreceptor ytre segmenter, romlig bufring av ioner, transport av næringsstoffer, ioner og vann i tillegg til aktiv deltakelse i visuelle syklus. Med slike viktige og ulike funksjoner er det kritisk viktig å studere biologi av RPE celler. RPE cellen linjer er etablert; men er passaged og udødeliggjort celler kjent for å raskt miste noen morfologiske og fysiologiske kjennetegner naturlig RPE celler. Dermed er primære celler mer egnet for å studere ulike aspekter av RPE cellebiologi og funksjon. Musen primære RPE cellekultur er svært nyttig for forskerne siden musen modeller er mye brukt i biologiske studier, men samle RPE celler fra musen er også svært utfordrende på grunn av sin lille størrelse. Her presenterer vi en protokoll for å etablere hovedknappen på musen RPE cellekulturer som inkluderer enucleation og Disseksjon av øynene og isolasjon av RPE ark til cellene for dyrking. Denne metoden gjør det mulig for effektiv celle utvinning. RPE cellene fra to mus kan nå confluency på en 12 mm polyester membran setter forhåndsinstallert i kultur plate etter en uke av kultur og vise noen av den opprinnelige egenskapene til bona fide RPE celler som Sekskantet form og pigmentering etter to uker kultur.
Introduction
Netthinnens pigment epitel (RPE) er en enkelt lag av polarisert epitelceller som ligger mellom neural netthinnen og akkord av øyet. Funksjonaliteten til RPE cellene og integriteten til den RPE monolayer er avgjørende for visjon fordi RPE spiller en stor rolle i flere prosesser som opprettholde ytre blod-retinal barrieren, vann og ioner mellom netthinnen og choroid, lys absorpsjon, beskyttelse mot oksidativt stress, kontroll av retinoid metabolisme og fagocytose av de ytre delene av fotoreseptorer1,2. Plasseringen av RPE på baksiden av øyet, samt barriere funksjonen forhindrer narkotika administrert systemisk fra passerer fra blodet til glasslegemet humor, gjør det vanskelig å studere kompleksiteten av RPE funksjonen i vivo. Derfor finnes det et stort behov for etablering av RPE cellekulturer å studere RPE cellene i en fleksibel, kontrollert miljø3,4.
Etablerte RPE cellen linjer finnes, gir en enkel og praktisk måte å skaffe og lagring i celler. men har passaged celler noen ulemper i forhold til primære celler2,3,4. Først, de er ofte preget av endringer i celle morfologi. For eksempel ble ingen av de eksisterende linjene funnet for å være egnet for en pålitelig studie av RPE barriereegenskaper tap av cellen polaritet fenotypen og delvis forsvinningen av tett veikryss4. I tillegg til tapet av polaritet og riktig celle til celle forbindelser mister RPE celle linjene raskt sin pigmentering på grunn av fravær av nøkkelen melanogenesis enzymer i voksen RPE5. Pigmentering kan gjenopprettes, men omfattende analyse av mekanismen av re-pigmentering som inkluderer en kombinasjon av overføring elektronmikroskop, gene expression analyse og kjemiske analyser å bekrefte tilstedeværelse av melanin har aldri vært utført6. En mer begrensning er at de RPE linjene har utvidet celle liv (noen ganger – udødelighet) og under visse betingelser kan forvandle selv fornyende multipotent stamceller som kobler substrat og skjemaet flytende kolonier7, 8. denne begrensningen gjør det umulig å bruke celle linjene for transplantasjon eksperimenter3.
Vurderer ulempene med de etablerte RPE linjene, primære RPE cellekulturer fra friskt vev kan tjene som mer biologisk relevante modell å studere i RPE. Primære RPE cellene har blitt brukt ikke bare å studere RPE-spesifikke funksjoner som vitamin A metabolisme9, fagocytose photoreceptor ytre segmenter10 og ion transportere11, men også å studere grunnleggende cellebiologi som epithelial celle polaritet2 og lysosomale homeostase autophagy12,13.
I de siste par årene har det vært en rekke publikasjoner om å etablere primære RPE kulturer, viser en økende interesse i dette området av forskning3,14,15. Flere protokoller for menneskelige RPE celler og ikke-menneskelige RPE celler som storfe og svin RPE celler ble publisert16,17,18,19. Men er det vanskeligere å håndtere musen RPE celler på grunn av deres mye mindre størrelse. Selv om ganske mange publikasjoner har beskrevet for å isolere RPE celler fra musen14,20,21, er det fortsatt mange forskere sliter med å isolere RPE celler uten forurensning av choroid celler eller celler fra neural netthinnen rusk. Her presenterer vi protokollen for å etablere hovedknappen på musen RPE cellekultur, inkludert å få øynene fra mus, Disseksjon av øynene og isolasjon av RPE ark til cellene for dyrking. Denne video protokollen ville være spesielt nyttig for forskerne som begynner å arbeide med musen primære RPE kulturer og trenger veiledning på disseksjon teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presenteres detaljert protokollen kan pålitelig etablering av musen primære RPE kulturer som nå confluency etter 1 uke og presentere RPE hovedegenskapene som Sekskantet form og pigmentering etter 2 uker. Innhentet RPE cellene kan brukes til en rekke nedstrøms programmer som vitamin A metabolisme9, fagocytose photoreceptor ytre segmenter10 og ion transport11, tarmepitelet polaritet2lysosomale homeostase, og autophagy<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien var delvis finansiert av BrightFocus stiftelsen (som DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
