جمع الأنسجة الدهنية للماوس وتجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي
Summary
والغرض من هذه الورقة تقديم إجراء خطوة بخطوة جمع مختلف الأنسجة الدهنية البيضاء من الفئران وتجهيز العينات الدهون واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
مقارنة بالانسجة الأخرى، لديه الأنسجة الدهنية البيضاء محتوى الرنا والبروتين أقل بكثير للمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل PCR الوقت الحقيقي ولطخة الغربية، نظراً لأن معظمها يحتوي على الدهون. هو أيضا تحدي عزل الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة الدهنية كخطوات إضافية مطلوبة لتفادي هذه الدهون. نقدم هنا، إجراء لجمع الأنسجة الدهنية البيضاء مختلفة تشريحيا ثلاثة من الفئران، لمعالجة هذه العينات وإجراء عزل الحمض النووي الريبي. يصف لنا كذلك تجميع لتجارب التعبير كدنا والجينات باستخدام PCR الوقت الحقيقي. وصف بموجب هذا البروتوكول يسمح للحد التلوث من الشعر والدم على منصات الدهون، فضلا عن التلوث المتبادل بين مختلف منصات الدهون أثناء جمع الأنسجة للحيوان. كما أنه تم الأمثل لضمان كمية كافية ونوعية من الحمض النووي الريبي المستخرج. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على نطاق واسع لأي نموذج الماوس حيث عينات الأنسجة الدهنية مطلوبة لتجارب روتينية مثل PCR الوقت الحقيقي ولكن ليس المقصود لعزله من ثقافة الخلية adipocytes الأولية.
Introduction
وتعد السمنة وباء في جميع أنحاء العالم التي يمكن أن تؤدي إلى مضاعفات مثل نوع 2 من داء السكري1. كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا والسمنة المفرطة الناجمة عن النظام الغذائي للبحوث في السمنة والمضاعفات المرتبطة به. تقليديا، النسيج الدهني الأبيض المعروف حجرة تخزين للطاقة الزائدة، وهي في معظمها تتألف من الدهون بينما النسيج الدهني البنى تحويل الطاقة إلى حرارة2،3. الأنسجة الدهنية الحيوية وسيتم توسيع ويتقلص تبعاً للعديد من العوامل مثل تناول الغذاء والنشاط البدني. ومن ثم لتحديد العوامل المساهمة في هذه التغيرات، هي مجموعة كافية من الأنسجة الدهنية ومعالجة المطلوبة4.
بين الأنسجة الدهنية البيضاء، ومن المقبول عموما أن مستودعات الدهون تحت الجلد والبطن لها خصائص مختلفة مثل التعريب التشريحية ووظيفة2،5. ونتيجة لذلك، لتجنب نتائج متضاربة أو تقلب كبير، يحتاج الاهتمام الواجب اتخاذها لتجنب التلوث المتبادل بين هذه المستودعات فات مختلفة عند تجميع منصات الدهون.
وعلاوة على ذلك، هناك ثلاثة تحديات رئيسية عند عزل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء. أولاً، جمع منصات الدهون في الفئران السمنة ليست مهمة سهلة الحدود التي تفصل بين مختلف مخازن الدهون البيضاء ليست دائماً واضحة، خلافا للأجهزة الأخرى مثل الكليتين والقلب6. ثانيا، بسبب المحتوى الدهني المرتفع من الأنسجة الدهنية، من خلال عزل الحمض النووي الريبي أو البروتين، يطفو على أعلى طبقة من الدهون ويمنع الوصول المباشر للعينة. ثالثا، بدلاً من النسيج الدهني البنى أو الأنسجة الأخرى، قد الأنسجة الدهنية البيضاء أقل بكثير من محتوى البروتين والحمض النووي الريبي وهذا مصدر قلق كبير عند استخدام الفئران الصغار وتغذية الفئران اتباع نظام غذائي عادي (ن) والفئران التي من المتوقع أن يكون منخفض الدهون الجماهير (أي ممارسة نماذج كو، والعلاج بالعقاقير، والتدريب، إلخ.) 7 , 8.
ولذلك، اختيار الطريقة المناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. أساليب بديلة لاستخراج الفينول/كلوروفورم مجموعات تجارية. أنها تقوم عادة على خطوة استخراج فينول أولى، تليها تنقية الحمض النووي الريبي في عمود9. هذه المجموعات عادة ما تكون أكثر تكلفة وإعطاء عينات من انخفاض الغلة، في حين قد تكون نوعية الحمض النووي الريبي متغير ولكن هي أقل استهلاكاً للوقت. بيد واحدة من أكبر مزايا لاستخراج الحل/كلوروفورم الفينول الموصوفة هنا هو إمكانية عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين من عينة واحدة10. منذ منصات الفئران الدهون عادة ما تكون صغيرة، وإعطاء كمية صغيرة من الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات (خاصة في نماذج الفأر الهزيل)، تعظيم هذه البروتوكولات البيانات واحدة يمكن الحصول على الخروج من عينة صغيرة.
والهدف من هذه الورقة تقديم وصف مفصل عن طريقة لضمان تحصيل عينة كافية من مستودعات الأنسجة الدهنية ثلاثة فئران بيضاء، فضلا عن كمية ونوعية لعزل الحمض النووي الريبي. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها عن طريق اتباع هذا البروتوكول لإجراء فحوصات PCR الوقت الحقيقي. وليس المقصود هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من المستزرعة adipocytes الرئيسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التالي التردد-الحمية التغذية، تم العثور على الفئران السمنة زادت الجسم والأنسجة الدهنية البيضاء الأوزان مقارنة بالفئران التي تغذت ن. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة باستخدام الفينول الحل أسفرت عن عينات بنقاوة جيدة. اللبتين هو أديبوكيني الدرجة الأولى التي تنتجها الأنسجة الدهنية وهو معرو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل كندا السكري.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
