최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜
Summary
이 문서에는 다른 긴장, 종, 그리고 다른 장기 나 조직에 사용 하기 위해 적용할 수 있는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염료 메서드를 사용 하 여, 최적화 된, 경제적이 고 간단한 프로토콜 설명 합니다.
Abstract
혈관 누출 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 원인, 수 있으며 심각한 결과 또는 염증 반응의 증상이 있을 수 있습니다. 이 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법을 궁극적으로 발생할 수 있습니다. 연구원은 가장 좋은 방법 플라즈마 넘쳐 흐름을 공부에 대 한 사용할 수를 포함 하 여 적절 한 도구는 중요 하다. 이 문서에서 우리는 FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한 에반스 블루 염색 방법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 의도적으로 간단를 훌륭한 가능한 정도 하지만 제공 한다 고품질 데이터. 주로 하기 때문에 그것은 쉽게 사용 하 여 평균 실험실 에반스 블루 염료 선정 되었습니다. 우리 효소 neprilysin 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설에 대 한 증거와 지원을 제공 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. 그러나이 프로토콜을 실험적으로 사용 하 고 쉽게 이해, 예방, 또는 치료에서 중요 한 다른 요소를 포함할 수 있습니다 연구에 대 한 쥐의 다른 긴장에 또는 다른 종에서 많은 다른 장기 또는 조직에서 사용 하기 위해 적응 수 있습니다, 플라즈마 넘쳐 흐름입니다. 이 프로토콜은 광범위 하 게 최적화 및 사용, 경제, 및 재료와 장비,이 프로토콜에 사용 하 여 평균 실험실에 대 한 우수한 만들기의 일반적인 가용성의 용이성 기존 프로토콜과 결합 안정성에서 수정 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름 측정
Introduction
장기에 혈관 누출 넘쳐 흐름, 참조 또는 누설의 피에서 생산 하는 격차를 통해 혈장의 장기에 모 세관 venules 게시. 이 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 증가 혈관 침투성, 선 동적인 응답의 어떤 종류에서 발생할 수 있는 중대 한 결과 있을 수 있습니다. 따라서, 그것은이 현상, 그, 변조기, 원인과 결과, 공부 하 고, 이해는 하 고 마찬가지로, 그 수 사관 좋은 도구 고 프로토콜 들을 공부 하는. 내 피 간격 다양 한 자극을 통해 생성 될 수 있습니다 하지만 일반적으로 endothelia에 tachykinins 펩 티 드 신경 전달 물질의 작용에 의해 생산 됩니다. Undecapeptide tachykinin neuropeptide, 물질 P1증가 플라즈마 넘쳐 흐름에서 결과,이 과정의 주요 자연적 중재자 중 하나입니다.
에반스 블루 염료의 알 부 민-바인딩 속성을 사용 하 여 조사 하 고 혈관 침투성 또는 플라즈마 넘쳐 흐름, 측정 방법 개발 되었습니다, 그리고 일반적으로 그들의 정확도, 단순, 경제, 안전, 그리고 허용 하는 기능에 대 한 알려져 있다는 플라즈마 넘쳐 흐름 여러 조직에서 한 번에 결정 그렇다면 원하는2,3,,45,6,,78,9 . FVBN 쥐의 장기에서 플라즈마 넘쳐 흐름을 평가 하기 위한이 에반스 블루 프로토콜, 사용 하지만 일반적으로 유용 하 고 적응력이 미래 연구를 실시 하 고 또는 평균 실험실을 포함 하는 몇 가지 중요 한 수정 추가 플라즈마 넘쳐 흐름 또는 혈관 침투성와 관련 된 요인의 중요 한 연구를 실시 합니다. 이 프로토콜에서 물질 P 1 nmol/kg, 1.5-fold에 의해 플라즈마의 넘쳐 흐름을 증대는에 쥐에 소개 된다. 이 프로토콜, 더 쉽게 관찰 하 고 얻을 수 있는 결과에 결과의 감도 증가 합니다. 침투성, 다양 한 다른 펩 티 드, 화학, 등 어떤 형태의 독성 부상에 영향을 주는 다른 요인 또는 사용 수 있습니다 원하는 대로 다른 실험실에 의해 공부. 경 정 맥 주사는 터미널 수술을 요하는 에반스 블루와 물질 P를 체계적으로, 소개 하는 것이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 경 정 맥 주사5,7,10을 필요한 터미널 수술 기법의 고려 사항 후에는 쉽게 마스터 하 고 다른 사람 보다 더 일관 된 결과의 생산으로 이어질 꼬리를 포함 하 여 정 맥 주사, 주사4,9정 맥. 복고풍 궤도 정 맥 공동 주사에 의해 배달 될 블루 에반스에 대 한 수 있습니다, 비록 문학에서 참조가 없습니다 발견 되었습니다 에반스 블루의 납품의이 메서드를 사용 하는. 그러나, 꼬리 정 맥 주사에 대해서 높은 수준의 전문성과 reproducibly 크게이 기술을 마스터 하는 것 성공적인 에반스 블루 주사에 대 한 그것의 사용을 제한 합니다. 반면, 대체 경 정 맥 주입 방법 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 기술적으로 얻을 수 있는 솔루션을 제공 합니다. 마우스의 혈관의 관류에 대 한 중요 한 절차 수행 직후 에반스 블루 끼얹는다 마우스의 희생 초과 에반스 파란색 염료를 제거 하 고이 프로토콜 표준화 되었습니다. 관류의 앞에서 설명한 방법은 신중 하 게 검사 하 고 되었습니다 현재 절차를 수정. 여기에 설명 된 다른 수정 모두 최적화 하 고, 간단 하 고 저렴 한 있습니다.
에반스 블루 염색 방법의 몇 가지 중요 한 제한이 있습니다. 예를 들어 낮은 감도 가끔이 방법으로 관련 된 몇 가지 추가 총 병 리 학적 및 조직학 검사 조직의 에반스 블루 주입 동물에서 방지할 수 있습니다. 그러나,이 및 다른 제한은 그럼에도 불구 하 고, 여전히 에반스 블루를 사용 하는 모델과 다른 방법의 개발에 이르렀다. 에반스 블루의 측정 형광 (여 보다 시각 범위) 분광학 방법의 감도 증가 시킬 수 있습니다. 또한, 형광 현미경 검사 법 에반스 블루 스테인드 직물의 더 뚜렷한 위치11혈관 누출의 관찰에 대 한 허용 하도록 개발 되었다. 또한, 전체-바디 이미징 및 살아있는 동물의 스캔 이전 에반스 블루12 연속 방식에서 에반스 블루 농도의 조사에 대 한 수와 함께 주입 보다는 실험의 시간을 선택 하는 한 특정 시점. 그러나,이 메서드는 적절 한 영상 시설의 가용성을 필요로 하며 매우 비쌀 수 있습니다. 수정 에반스 블루와 수행 모델의 생체 외에서 종류에 관련 된와 같은 셀에 문화 또는 병아리 chorioallantoic 모델13 (CAM)는 또한 설명. 이러한 모델14 intravital 현미경 검사 법, 형광에 의해 모니터링 됩니다 시간이 지남에, 혈관 침투성 변화의 정량화를 허용 하지만 비보에 조건의 정확한 모델링에 관한 질문을 올릴 수 있고 수도 있습니다. 비싼.
에반스 블루의 관리를 포함 하지 않는 다른 방법을 결정 하 고 계량 혈관 누출 또는 침투성, 개발 되었습니다. 이러한 메서드 (예: 알 부 민 또는 fluorescein), 적절 한 형광 분자 또는 isotopically 레이블 또는 기타 태그 분자, 동물을 살 수를 고용할 수 있습니다 (또는 세포 문화 또는 chorioallantoic (캠)을 모델13, 비-침략 적 이어서 (애완 동물 스캐닝, MRI, intravital 현미경 검사 법, 전신 스캔) 이미징 또는 침략 이미징 (형광 현미경 검사 법)3,,1215. 이러한 기술을 다양 한 장점이 다른 에반스 블루 방법을 제공할 수 있습니다, 하지만 그들은 또한 그들의 상당한 복잡성, 필요한 전문 지식, 자원, 및 높은 금융 비용 포함 될 수 있습니다 있는 불리 있다.
Neprilysin16 (peptidase 효소 NEP, 또한 CD10, MME, 또는 Enkephalinase) 효소 대사와 내 인 성 물질 피의 비활성화를 통해 부분에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 적어도 억제에 참여 제안 되었습니다. 따라서, 조직 세포 표면 peptidase NEP 발생 하는, 있을 수 있습니다 아마도 묻힐 peptidase 활동으로 물질 p, 효과의 감쇠
처음에, 우리는 FVBN 야생 타입 (WT)와 NEP 녹아웃 (KO) 마우스 수정된이 에반스 블루 프로토콜을 이용 하 여 물질 P 유도 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 테스트. 물질 P 증강 플라즈마 넘쳐 흐름에 NEP 참여 이러한 초기 연구에서 의심 되었다 우리는 이것을 설명 하 고 추가 플라즈마 넘쳐 흐름에 관련 된 NEP의 역할 실험. 그러나,이 원고는 하지 NEP 또는 그것의 역할에서 플라즈마 넘쳐 흐름, 오히려 플라즈마 넘쳐 흐름 스스로 실험. NEP 결과이 수정된 프로토콜의 사용을 통해 얻을 수 있는 결과의 종류를 대표 합니다. 플라즈마 넘쳐 흐름을 측정 하는 에반스 블루 메서드 최적화 되었고 수정, FVBN 마우스 아래 자세히 설명 된 대로.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명 했 듯이, 플라즈마 넘쳐 흐름의 연구의 원인에 관한 새로운 지식 또는 억제 또는 플라즈마 넘쳐 흐름을 치료 하는 새로운 방법에 궁극적으로 이어질 수 있습니다. 현재 원고에서 플라즈마 넘쳐 흐름 프로토콜 (위)의 성공적인 사용 입증 되었습니다 에반스 파란색 염료를 사용 하 여. 표시 된 데이터를 다시 있지만 NEP는 맥 관 구조를 보호 수 있습니다 가설 플라즈마 넘쳐 흐름에 대 한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 귀중 한 도움과 편집이이 원고에 대 한 앤디 Poczobutt와 박사 파주시 조리 Leszczynski 감사 하고자 합니다. 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 RO3 HL095439) 및 학과의 재향 군인의 업무 (가치 평가)에서 받은 보조금으로 지원.
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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