אוונס ממוטבת כחול פרוטוקול כדי להעריך את דליפת דם העכבר
Summary
במאמר זה מתואר פרוטוקול חסכוני, אופטימיזציה, ופשוט אשר משתמשת בשיטת צבע כחול אוונס להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN אשר ניתן להתאים לשימוש זנים אחרים, מינים, ואת שאר איברים או רקמות.
Abstract
דליפת דם, או פלזמה extravasation, יש מספר סיבות, עשוי להיות עם תוצאה חמורה או סימפטום מתגובה דלקתית. מחקר זה עשוי להוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. חשוב כי החוקרים יש כלים מתאימים, כולל את השיטות הטובות ביותר הזמינות, לימוד פלזמה extravasation. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול, שימוש בשיטת הצבע הכחול אוונס, להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN. פרוטוקול זה היא פשוטה במכוון, כדי גדול תואר ככל האפשר, אבל מספק נתונים באיכות גבוהה. אוונס כחול צבע נבחר בעיקר כי זה קל עבור המעבדה הממוצע להשתמש. השתמשנו פרוטוקול זה לספק ראיות ותמיכה עבור ההשערה כי neprilysin האנזים עשויה להגן את להערכת כנגד פלזמה extravasation. עם זאת, פרוטוקול זה ייתכן השפעול בשימוש ויש להתאים בקלות לשימוש זנים אחרים של עכברים או מינים אחרים, רבים איברים שונים או רקמות, עבור מחקרים אשר עשוי לכלול גורמים אחרים, חשובים להבנת, מניעת או לטיפול extravasation פלזמה. פרוטוקול זה הותאם בהרחבה, שונה מן הפרוטוקולים הקיימים, המשלב אמינות, להקל על השימוש, הכלכלה, ואת הזמינות הכללית של חומרים וציוד, הפיכת פרוטוקול זה מעולה עבור המעבדה הממוצע להשתמש ב לכימות פלזמה extravasation של איברים.
Introduction
דליפת דם באברים מתייחס extravasation, או דליפה של פלזמה דם דרך פערים מיוצר על אנדותל של פוסט venules נימי באיברים. Extravasation פלזמה או חדירות כלי דם מוגבר, אשר עשויה לנבוע סוג מתגובה דלקתית, זו עשויות להיות השלכות חמורות. לכן חשוב כי תופעה זו, את הסיבות, מאפננים, וההשלכות, הם למדו והבינו, באופן דומה, כי החוקרים יש יופי כלים, פרוטוקולים שבה ללמוד אותן. הפערים אנדותל עשויים להיווצר באמצעות שורה של גירויים, אך בדרך כלל מיוצרים על ידי הפעולה של נוירוטרנסמיטורים פפטיד ו/או tachykinins על endothelia. אחד המתווכים המתרחשים באופן טבעי העיקריים של תהליך זה, דבר המתבטא פלזמה מוגברת extravasation, הוא undecapeptide tachykinin neuropeptide, חומר P1.
שיטות כדי לחקור ולמדוד את חדירות כלי דם או פלסמה extravasation, אשר להשתמש במאפיין אלבומין-איגוד של צבע כחול אוונס, פותחו, ידועים בדרך כלל עבור דיוק, פשטות, הכלכלה, ביטחונם, היכולת לאפשר קביעת extravasation פלזמה רקמות כמה בבת אחת, אם כן רצוי2,3,4,5,6,7,8,9 . פרוטוקול זה אוונס כחול להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN משתמשת כל אלה, אך מוסיף כמה שינויים חשובים, זה עושה את זה בדרך כלל שימושי וישימה עבור מחקרים עתידיים, מעורבים הממוצע המעבדה מבצעת או יהיה לנהל מחקרים חשובים של גורמים הקשורים extravasation פלזמה או חדירות כלי דם. ב פרוטוקול זה, חומר P הוא הציג העכברים-1 nmol/ק ג, אשר מרחיב את extravasation של פלזמה על-ידי 1.5-fold. זה מגביר את הרגישות של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך תוצאות הנצפה, השגה בקלות רבה יותר. גורמים נוספים שמשפיעים על חדירות, כמו פפטידים שונים אחרים, כימיקלים או כמה צורות של פגיעה רעילים, עשוי להשתמש בו או נחקר על ידי מעבדות אחרות, כרצונכם. זריקות ומוחלף נמצאים בשימוש פרוטוקול זה להציג את אוונס כחול, חומר P מערכתית, אשר דורש ניתוח מסוף. עם זאת, ומוחלף זריקות5,7,10, גם לאחר התחשבות הטכניקות הנדרשות מסוף כירורגי, קלים יותר לשלוט ולהוביל הייצור של תוצאות עקביות יותר מהאחרים זריקות ורידים, כולל הזנב הווריד זריקות4,9. למרות שזה עשוי להיות אפשרי אוונס כחול מועברת על ידי זריקות סינוסים ורידים רטרו-מסלולית, אין הפניות בספרות נמצאו זה להשתמש בשיטה זו של מסירת אוונס כחול. אולם, לגבי זריקות וריד הזנב, רמה גבוהה של מומחיות ותרגול לשלוט בטכניקה זו reproducibly באופן משמעותי מגביל את השימוש זריקות אוונס כחול מוצלחת. לעומת זאת, בשיטת הזרקת אלטרנטיביות. ווריד הצוואר כפי שמתואר הפרוטוקול שלנו מציע פתרון טכנית השגה. שגרה מכריע עבור זלוף של הוורידים של העכבר, לבצע רק לאחר ההקרבה של אוונס perfused כחול העכבר, מסיר עודפי צבע כחול אוונס, בוצע שעבר סטנדרטיזציה של פרוטוקול זה. שיטות שתואר לעיל זלוף כבר בזהירות בדק, שונה כדי לקבל את ההליך הנוכחי. שינויים אחרים המתוארים כאן הם כל ממוטבת, פשוטה וזולה.
ישנן כמה מגבלות חשובות של השיטה צבע כחול אוונס. לדוגמה, רגישות נמוכה המשויכות לעתים שיטה זו עלולה למנוע כמה נוספים ברוטו פתולוגיים ומאפיינים היסטולוגית בדיקה של רקמות מחיות המוזרק כחול אוונס. עם זאת, אלה ומגבלות אחרות הובילו לפיתוח שיטות אלטרנטיביות ומודלים זה, בכל זאת, עדיין להשתמש אוונס כחול. המדד של אוונס כחול על-ידי קרינה פלואורסצנטית (במקום visual-טווח) ספקטרוסקופיה עשוי להגביר את הרגישות של השיטה. בנוסף, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של אוונס מוכתם כחול רקמות פותחה כדי לאפשר התבוננות דליפת דם מיקומים ברורים יותר11. בנוסף, לכל הגוף הדמיה וסריקה של-חיים בעבר הזריקו אוונס כחול12 מאפשר חקירה של ריכוזים אוונס כחול באופן רציף, במקום ספציפי אחד נבחר הזמן בנקודה של הניסוי. עם זאת, שיטה זו דורש את הזמינות של מתקני הדמיה המתאימה, וזה עשוי להיות יקר מאוד. השינויים הכרוכים אוונס כחול והושמעה בסוג במבחנה של מודל, כגון בתא תרבות או דגם chorioallantoic13 (CAM) גם תוארו. מודלים אלה מפוקח על-ידי קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופ intravital14 , לאפשר כימות של חדירות כלי דם שינויים לאורך זמן, אבל עלול להעלות שאלות הנוגעות דוגמנות מדויק של תנאים ויוו ו אולי גם יקר.
היו שיטות אחרות שפותחו כדי לקבוע ולכמת דליפת דם או חדירות, שאינן כוללות את הניהול של אוונס כחול. שיטות אלה עשויה להשתמש של מולקולה פלורסנט המתאים (כגון אלבומין או fluorescein), או isotopically עם תוויות או אחרת מתויג מולקולה, לחיות חיות (או לתא תרבות או chorioallantoic (CAM) מודלים13, ואחריו לא פולשנית הדמיה (PET סריקה, MRI, מיקרוסקופ intravital, כל הגוף סריקה) או על-ידי פולשני הדמיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)3,12,15. למרות הטכניקות הללו עשויים להציע מספר יתרונות על פני אחרים אוונס שיטות כחול, יש להם גם חסרונות, אשר עשויים לכלול שלהם ניכר המורכבות הנדרשות מומחיות, משאבים, עלויות כספיות גבוהות.
Neprilysin16 (peptidase האנזים NEP, הידוע גם בשם CD10, גברת או Enkephalinase) הוצע להיות מעורב עיכוב פלזמה extravasation, לפחות בחלקו, דרך מטבוליזם אנזימטי איון אנדוגני פ חומר לפיכך, ברקמות שבו מתרחשת תא השטח peptidase NEP, ייתכנו הנחתה השפעת חומר P, ככל הנראה על ידי פעילות peptidase NEP.
בתחילה, בדקנו עבור חומר P-induced פלזמה extravasation ניצול פרוטוקול זה אוונס כחולה ששונו, עם FVBN פראי סוג (WT) ועכבר נוקאאוט (KO) NEP. NEP מעורבות פלזמה בתוספת חומר P extravasation נחשד ממחקרים אלה הראשונית, אנו מתארים אלה, בהמשך הניסויים תפקיד של NEP מעורבים פלזמה extravasation. עם זאת, המוקד של כתב יד זה אינה NEP או תפקידה פלזמה extravasation, אלא מעדיף extravasation פלזמה הניסויים עצמם. התוצאות NEP הן נציג של סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות שימוש של פרוטוקול זה שונה. השיטה אוונס כחול כדי למדוד פלזמה extravasation יש כבר אופטימיזציה, שינוי, כפי שיתואר בפירוט להלן עבור עכברים FVBN.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שצוין לעיל, המחקר של פלזמה extravasation יוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. באמצעות צבע כחול אוונס, שימוש מוצלח של פרוטוקול extravasation פלזמה (לעיל), הוכח בכתב היד הנוכחי. למרות שהנתונים המוצגים בחזרה ההשערה כי NEP עשויה להגן על להערכת נגד extravasation …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות אנדי Poczobutt, ד ר Jori Leszczynski עזרה יקר, עריכות כתב היד הזה. הנתמכים על ידי מענקים שהתקבלו מתוך הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 ו- RO3 HL095439), המחלקה לענייני חיילים משוחררים של (Merit ביקורת).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
