En optimeret Evans blå protokollen at vurdere vaskulær lækage i musen
Summary
I denne artikel beskrives en økonomisk, optimeret og enkel protokol som bruger Evans blå farvestof metode til vurdering af plasma ekstravasation i organer af FVBN mus, der kan tilpasses til brug i andre stammer, arter, og andre organer eller væv.
Abstract
Vaskulær lækage eller plasma ekstravasation, har en række årsager, og kan være en alvorlig konsekvens eller symptom på en inflammatorisk reaktion. Denne undersøgelse kan i sidste ende føre til ny viden om årsagerne til eller nye måder at hæmme eller behandle plasma ekstravasation. Det er vigtigt, at forskere har de rette værktøjer, herunder de bedste metoder til rådighed, for at studere plasma ekstravasation. I denne artikel vil beskrive vi en protokol, ved hjælp af metoden Evans blå farvestof til vurdering af plasma ekstravasation i organer af FVBN mus. Denne protokol er bevidst simpelt, at så stor en grad som muligt, indeholder men data af høj kvalitet. Evans blå farve er blevet valgt, primært fordi det er let for den gennemsnitlige laboratorium til at bruge. Vi har brugt denne protokol til at levere dokumentation og support til den hypotese, at enzymet neprilysin kan beskytte Vaskulaturen mod plasma ekstravasation. Men denne protokol kan eksperimentelt anvendt og nemt tilpasses til brug i andre stammer af mus eller andre arter, i mange forskellige organer eller væv, for undersøgelser, der kan indebære andre faktorer, der er vigtige i forståelsen, forebyggelse eller behandling af plasma ekstravasation. Denne protokol er blevet grundigt optimeret og ændret fra eksisterende protokoller og kombinerer pålideligheden, lette, økonomi, og general anvendelighed af materialer og udstyr, hvilket gør denne protokol overlegen i forhold til den gennemsnitlige laboratorium til brug i kvantificere plasma ekstravasation fra organer.
Introduction
Vaskulær lækage i organer henviser til ekstravasation, eller udsivning af blodplasma gennem huller produceret i endothelium for post kapillær venules i organer. Denne plasma ekstravasation eller øget vaskulær permeabilitet, der kan opstå fra nogle type af en inflammatorisk reaktion, som kan have alvorlige konsekvenser. Det er således vigtigt, at dette fænomen, dets årsager, modulatorer og konsekvenser, er undersøgt og forstået, og ligeledes, at efterforskere har gode værktøjer og protokoller med at studere dem. I endothelial huller kan fremstilles via en række stimuli, men normalt er produceret ved hjælp af peptid neurotransmittere og/eller tachykinins på endothelia. En af de store naturligt forekommende mediatorer af denne proces, hvilket resulterer i øget plasma ekstravasation, er undecapeptide tachykinin neuropeptid, substans P1.
Metoder til at undersøge og måle vaskulær permeabilitet eller plasma ekstravasation, der bruger egenskaben albumin-bindingen af Evans blå farvestof, er blevet udviklet, og er normalt kendt for deres nøjagtighed, enkelhed, økonomi, sikkerhed og muligheden for at tillade den bestemmelse af plasma ekstravasation fra flere væv på én gang, ønskede så2,3,4,5,6,7,8,9 . Denne Evans blå protokol for at vurdere plasma ekstravasation i organer af FVBN mus bruger alle disse, men tilføjer nogle vigtige ændringer, der gør det generelt nyttigt og fleksibel til fremtidige undersøgelser, der involverer den gennemsnitlige laboratorium, der udfører eller vil gennemføre vigtige studier af faktorer i forbindelse med plasma ekstravasation eller vaskulær permeabilitet. I denne protokol, er substans P introduceret til mus på 1 nmol/kg, hvilket øger ekstravasation af plasma af 1.5-fold. Dette øger følsomheden af den protokol, hvilket resulterer i mere nemt observerbare og opnåelige resultater. Andre faktorer, der påvirker permeabilitet, som forskellige andre peptider, kemikalier eller nogle former for toksisk skade, kan bruges eller studeret af andre laboratorier, som ønsket. Halsfedt injektioner anvendes i denne protokol til at indføre Evans blå og substans P systemisk, som kræver terminal kirurgi. Men halsfedt injektioner5,7,10, selv efter overvejelse af de nødvendige terminal kirurgiske teknikker, er lettere at styre og føre til udarbejdelse af mere konsekvente resultater end andre venøse injektioner, herunder hale vene injektioner4,9. Selv om det kan være muligt for Evans blå leveres af retro-orbital venøse sinus injektioner, har ingen referencer i litteraturen fundet at bruge denne metode til levering af Evans blå. Men som for tail vene injektioner, den høje grad af ekspertise og praksis til reproducerbar mestrer denne teknik stærkt begrænser dets anvendelse til vellykket Evans blå injektioner. Derimod tilbyder alternative halsfedt injektion metode som beskrevet i vores protokol, en teknisk opnåelige løsning. En afgørende procedure for perfusion af musens vener, udføres lige efter ofringen af Evans blå-perfunderet mus, fjerner overskydende Evans blå farvestof, og er blevet standardiseret i denne protokol. Tidligere beskrevne metoder af perfusion er blevet nøje undersøgt og ændret for at opnå den nuværende procedure. Andre ændringer, der er beskrevet her er alle optimeret, ligetil og billig.
Der er nogle vigtige begrænsninger af metoden Evans blå farvestof. For eksempel, kan lav følsomhed undertiden forbundet med denne metode forhindre nogle ekstra grov patologiske og histologiske undersøgelse af væv fra Evans blå-indsprøjtning dyr. Men disse og andre begrænsninger har ført til udviklingen af alternative metoder og modeller, der dog stadig bruger Evans blå. Måling af Evans blå af fluorescens (ikke af visuel-range) spektroskopi kan øge følsomheden af metoden. Derudover blev Fluorescens mikroskopi af Evans blå-farvede væv udviklet for at give mulighed for observation af vaskulær lækage i flere forskellige steder11. Også, hele kroppen imaging og scanning af et levende dyr tidligere injiceres med Evans blå12 giver mulighed for undersøgelse af Evans blå koncentrationer på en sammenhængende måde, snarere end en specifik tid valgt punkt af eksperimentet. Men denne metode kræver tilgængeligheden af passende imaging faciliteter, og kan være meget dyrt. Ændringer der involverer Evans blå og udført i en in vitro- type model, er som i en celle kultur eller kylling chorioallantoic model13 (CAM) også blevet beskrevet. Disse modeller er overvåget af fluorescens og intravital14 mikroskopi, og giver mulighed for kvantificering af vaskulær permeabilitet ændringer over tid, men kan rejse spørgsmål om nøjagtig modellering af i vivo betingelser og kan også være dyrt.
Der har været andre metoder udviklet til bestemmelse og kvantificering af vaskulær lækage eller permeabilitet, der ikke involverer administrationen af Evans blå. Disse metoder kan ansætte en passende fluorescerende molekyle (såsom albumin eller fluorescein), eller en brændselsfremstilling mærket eller på anden måde mærkede molekyle, at levende dyr (eller til celle kultur eller chorioallantoic (CAM) modeller13, efterfulgt af ikke-invasive Imaging (PET scanning, Mr, intravital mikroskopi, hele krop scanning) eller af invasive billeddannelse (fluorescerende mikroskopi)3,12,15. Selv om disse teknikker kan tilbyde en række fordele i forhold til andre Evans blå metoder, har de også ulemper, der kan omfatte deres betydelig kompleksitet, nødvendige ekspertise, ressourcer og høje monetære omkostninger.
Neprilysin16 (peptidase enzymet NEP, også kendt som CD10, MME eller Enkephalinase) er blevet foreslået for at være involveret i at hæmme plasma ekstravasation, i det mindste i en del gennem enzymatisk metabolisme og inaktivering af endogent stof P. Således, i væv hvor celle overflade peptidase NEP forekommer, kan der være en dæmpning af effekten af substans P, formentlig af peptidase aktivitet af NEP.
I første omgang, testede vi for substans P-induceret plasma ekstravasation udnytter denne ændrede Evans blå protokol, med FVBN vildtype (WT) og NEP knockout (KO) mus. NEP inddragelse i substans P-augmented plasma ekstravasation var mistænkt fra disse indledende undersøgelser, og vi beskrive disse og yderligere eksperimenter involverer NEP rolle i plasma ekstravasation. Fokus i dette håndskrift er ikke NEP eller dens rolle i plasma ekstravasation, men snarere plasma ekstravasation eksperimenter selv. NEP resultaterne er repræsentative for slags resultater, som kan opnås gennem brug af denne ændrede protokol. Evans blå metode til at måle plasma ekstravasation er optimeret og ændret, som beskrevet i detaljer nedenfor for FVBN mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som omtalt ovenfor, kan studiet af plasma ekstravasation i sidste ende føre til ny viden om årsagerne til eller nye måder at hæmme eller behandle plasma ekstravasation. Vellykket brug af plasma ekstravasation protokollen (ovenfor), er ved hjælp af Evans blå farvestof, blevet påvist i det aktuelle manuskript. Selv om de viste data tilbage den hypotese, at NEP kan beskytte Vaskulaturen mod plasma ekstravasation, dette er en sekundær mål i øjeblikket, med det primære mål er at præsentere en optimeret protokol, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Andy Poczobutt og Dr. Jori Leszczynski til deres værdifulde hjælp og redigeringer til dette håndskrift. Støttet af tilskud modtaget fra det nationale hjerte, lunge og Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 og RO3 HL095439) og Department of Veterans anliggender (Merit anmeldelse).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
