Изучение Monosynaptic соединения у дрозофилы , используя устойчивые Тетродотоксин натриевые каналы
Summary
Эта статья имеет метод для тестирования monosynaptic связей между нейронами, используя Тетродотоксин и устойчивостью Тетродотоксин натриевых каналов, NaChBac.
Abstract
Здесь новый метод называется Tetrotoxin (TTX) инженерии сопротивления для зондирования синапсов (TERPS) применяется для проверки на monosynaptic связей между нейронами целевой. Метод основан на совместное выражение трансгенных активатор с каналом Тетродотоксин стойкие натрия, NaChBac, в конкретных Пресинаптический нейрон. Соединения с предполагаемым пост синаптических партнерами определяются поклеточного записи присутствии TTX, который блокирует электрической активности нейронов, которые не выражают NaChBac. Этот подход может быть изменен для работы с любой активатор или кальция изображений как репортер соединений. TERPS добавляет растущий набор инструментов для определения подключения в сети. Однако TERPS является уникальным в том, что он также достоверно сообщает, сыпучих или объем передачи и распространения передачи.
Introduction
Одной из основных целей нейронауки является сопоставление связей между нейронами, чтобы понять, как информация течет через схемы. Многочисленные подходы и ресурсы стали доступны для тестирования для функциональной связи между нейронами в диапазоне моделей систем1,2. Для генерации наиболее точных электросхемы с помощью электрофизиологии, важно решить, являются ли наблюдаемые соединения между двумя ячейками прямой и monosynaptic против косвенной и полисинаптические. Золотой стандарт для изготовления это различие в млекопитающих нейронов является измерить задержку между одной action potentials в пресинаптическом клеток и начала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs) в второй нейрон. Monosynaptic соединения должны иметь короткие задержки несколько миллисекунд и низкой изменчивости3. Этот подход может быть сложным в беспозвоночных нейронов, потому что синапсы могут возникнуть в их дендритов далеко от соматических записи сайта, вызывая задержки в обнаружения благодаря давно electrotonic расстояния между постсинаптических проводимости и запись электрод. Такие задержки могут внести неясность в отношении поли-против monosynaptic взносов. Кроме того небольшие синаптических события могут распадаться до достижения соматических записи сайта и вождения сильнее Пресинаптический деятельности, вероятно, привлечь полисинаптические события.
Различные методы были разработаны для проверки для monosynaptic соединений в беспозвоночных. Один подход использует высокий двухвалентной катион растворы (Hi-ди), содержащие избыток мг++ и Ca++. Это решение блокирует полисинаптические соединения путем уменьшения вероятности выпуска и увеличение порога потенциал действия в пользу обнаружения monosynaptic ввода4,5. Определение точного соотношения мг++ ЦС++ требуется, однако, не является тривиальным и полисинаптические взносов может сохраняться даже скромные стимуляции6. Альтернативный подход, называемый GFP восстановление через Synaptic партнеров (ГРАСП) принимает преимущество близости между предварительной и постсинаптической мембраны, найдены на синапсы вывести monosynaptic подключения 7. Здесь компонент зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) выражается в один нейрон, и дополнительный фрагмент молекулы выражается в предполагаемый постсинаптических партнера. Наличие флуоресценции указывает, что две нейроны находятся в достаточно тесной близости разрешить восстановление GFP молекулы и подразумевает существование синапса. ХВАТКА может сообщить синапсы ложно, хотя, если две клетки тесно соединенный мембраны, как нерв или брошюре. Варианты ГРАСП ликвидации таких ложных срабатываний, привязывая Пресинаптический фрагмент GFP непосредственно к Синаптобревин, таким образом позволяя восстановление только на активных синапсы8. В то время как ХВАТКА и его варианты играют важную роль в определении функциональной связи у дрозофилы ЦНС, некоторые соединения могут не быть сделаны видимыми ГРАСП если расстояния между предварительной и постсинаптических партнеров относительно большой. Это особенно актуально в оценке объема передачи, связанные с neuromodulation9 или ингибирования ГАМК10.
Здесь взаимодополняющими и Роман метод показан для тестирования прямой monosynaptic соединений в дрозофилы ЦНС. Этот метод, называемый Тетродотоксин инженерии сопротивления для зондирования синапсов (TERPS), работает совместно выражением Тетродотоксин (TTX)-устойчивые натриевых каналов, NaChBac и активатор optogenetic в пресинаптической клетке во время записи от предполагаемого 9постсинаптических партнеров. Присутствии TTX вся деятельность, потенциал действия опосредованной подавляется в клетках отличных выражения NaChBac. NaChBac канал выборочно восстанавливает возбудимости в пресинаптическом целевой ячейки, разрешительные свет вызвала синаптической передачи. Этот метод позволяет сильный активации нейронов пресинаптическом, таким образом, что подключения могут быть решены что соматические записи при одновременном снижении вероятности вербовки полисинаптические цепей. Важно отметить, что эта техника позволяет исследование объема передачи и раскрывает распространения передатчика, освобождены от одного нейрона всей цепи. Кроме того TERPS может выявить химической природы связи через обычные фармакологии. TERPS подходит для использования в любой системе модель, которая позволяет трансгенных выражение TTX-нечувствительным натриевых каналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
TERPS анализ дополняет текущие методы, используемые для цепи, растрескивание, позволяя обнаружения синапсов между выявленными нейронов. В частности подход показывает monosynaptic соединения широко глушителей потенциалы действия с TTX при восстановлении возбудимости в совокупность нейронов с …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Джошуа певица, Джонатан Шенк, а также продуманный рецензентам для комментариев по рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить Бен Уайт и Гарольд закон для обсуждения вопроса о технике. Джонатан Шенк представила данные на рисунке 3A. Эта работа была поддержана грантом фонда Уайтхолла и NIH R21 на QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
