Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma
Summary
Dieser Artikel enthält einen aktualisierten Ansatz zum klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre System Orgel Formation, zu studieren, durch die Kombination von neuartige in-vitro- und in Ovo experimentellen Verfahren.
Abstract
Die Vogelgrippe Embryo wurde als ein experimentelles Modell von größter Bedeutung für die bahnbrechenden Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie. Mehrere Ansätze, die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären und die Verwendung der chorioallantoic Membrane (CAM), die Entwicklung von ektopische Gewebe reichen zurück bis in das letzte Jahrhundert zu erhalten. Heute bietet die Kombination aus diesen klassischen Techniken mit den letzten in-vitro- Methoden neuartige Perspektiven um Orgel Bildung weiter zu erforschen.
Hier beschreiben wir ein zweistufiges Konzept um – und Ende-Frühstadium der Organogenese zu studieren. Kurz, ist die embryonale Region mit dem mutmaßlichen Gebiet der Orgel von Wachteln Embryonen und angebaut in Vitro isoliert in einem organotypischen System (bis zu 48 Stunden). Kultivierten Gewebe sind anschließend auf der CAM ein Huhn Embryos gepfropft. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung sind voll ausgebildete Organe veredelte Gewebe entnommen. Diese Methode ermöglicht auch die Modulation der Signalwege durch die regelmäßige Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen und Genmanipulation der Gewebe im gesamten in-vitro- und in Ovo Entwicklungsschritte. Darüber hinaus kann Gewebe entwickeln bei jedem Zeitfenster zur Analyse ihrer Genexpression Profil (mit quantitativen PCR (qPCR), Microarrays, etc.) und Morphologie (bewertet mit konventionellen Histologie und Immundiagnostik) gesammelt werden.
Die experimentelle Prozedur dient als ein Werkzeug Orgel Bildung außerhalb der Vogelgrippe Embryo, von den frühen Stadien der Organogenese, voll ausgebildet und funktionelle Organe folgen.
Introduction
Vogelgrippe Embryonen haben in zukunftsträchtigen Entwicklungsbiologie Studien verbreitet wurde. Die Hauptvorteile des Aviären Modells gehören die Möglichkeit zum Öffnen der Eier, die relativ einfachen Zugang zu den Embryo und die Fähigkeit, Mikromanipulation durchführen. Einige Beispiele umfassen die klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre-System für das Studium Zelle Schicksal1, Anwendung von speziellen Wachstumsfaktoren der Embryo2und das Wachstum der ektopische Zellstrukturen in der CAM1,3, 4.
Um neue Einblicke in verschiedene Stadien der Orgel Formation zu erhalten, haben wir vor kurzem eine Methode entwickelt die Pfropfen Techniken mit in-vitro- Manipulation von embryonalen Gewebe5verbindet. Die zweistufigen Ansatz ermöglicht die Diskriminierung und Exploration von beiden frühen – und -spätstadien der Organogenese, die oft aufgrund der sehr dynamischen und komplexen Gewebe Interaktionen2begrenzt werden. Darüber hinaus das Fehlen von geeigneten Gewebe-spezifische Marker häufig schränkt die Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermodelle6. Diese neuartige Methode der zweistufigen Ansatz überwindet weitgehend solche Beschränkungen.
Frühstadium der Orgel Formation, in einem ersten Schritt untersuchen die Wachtel embryonalen Gebiet bestehend aus prospektiven Orgel Rudiment isoliert und gewachsen in einem in Vitro organotypischen System für 48 h. Während dieser Zeit kann pharmakologische Modulation der spezifische Signalwege durch Hinzufügen von Drogen auf das Kulturmedium5,7durchgeführt werden. Darüber hinaus kultivierten Gewebe gesammelt zu irgendeinem Zeitpunkt des in-vitro- Wachstum und sondiert für Genexpression (mit Methoden wie qPCR, Microarrays, etc.).
Im zweiten Schritt 48 h-kultivierte Gewebe sind dann auf der CAM ein Huhn (c) Embryo im embryonalen Tag (E) 8 (cE8) gepfropft (Hamburger und Hamilton (HH)-Etappen 33-35)8. Die CAM verhält sich wie eine vaskuläre Lieferant von Nährstoffen und Gas Austausch1,3,4 , veredelte Gewebe ermöglicht seine Entwicklung in Ovo für längere Zeit erlaubt. Diese experimentelle Schritt ist besonders gut geeignet um spätstadien der Organogenese zu studieren als voll ausgebildete Organe nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung5,9,10,11 gewonnen werden können . Morphologische Analyse erfolgt einfach durch konventionelle Histologie, angemessene Orgel Formation zu bestätigen und Spender Ursprung der Zellen durch Immunhistochemie mit Spezies-spezifische Antikörper (d.h., MAb Wachtel perinukleäre (QCPN)) identifiziert werden kann. Während der Inkubationszeit CAM können Transplantate auch in Anwesenheit von pharmakologischen Wirkstoffen angebaut und in jedem Stadium der Entwicklung, das Fortschreiten der Organogenese bewerten gesammelt werden.
Der hier beschriebene, in die Tiefe, zweistufigen Ansatz hat bereits in Figueiredo Et Al. beschäftigt 5 die Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu erkunden. Dementsprechend werden die inhärenten Besonderheiten der embryonalen Gebiete und Entwicklungsstadien der Organogenese beteiligt der Thymus und Nebenschilddrüsen unter vorgestellt.
Der Thymus und Nebenschilddrüsen Epithelien, entstammen zwar funktionell verschiedene, das Entoderm pharyngealen Beutel (PP)12. Stammen Vogelgrippe, die Epithelien dieser Organe aus der dritten und vierten PP Entoderm (3/4PP)12, während bei Säugetieren das zebrafischembryonen Epithel der 3PP entstammt und das Epithel der Nebenschilddrüsen aus dem 3PP und 3/4PP bei Maus und Mensch stammt, jeweils13,14.
Eines der frühesten Stadien bei der Bildung dieser Organe ist die Entstehung von diskreten Thymus und Nebenschilddrüse Domains in der gemeinsamen Primordium. Bei Hühnern können diese Domains von in Situ Hybridisierung mit spezifischen molekularen Markern, am E4.515identifiziert werden. Während Entwicklung voranschreitet, diese Orgel Rudimente individualisieren und aus dem Rachen zu trennen, während eine dünne Mesenchymale Kapsel, durch Neuralleiste stammenden Zellen gebildet, die sie (bei E5 umgibt; HH-stage-27). Später das zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (bei E6.5; kolonisiert HH-stage 30)12.
Wie in Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn1,12ist der zweistufigen Ansatz besonders nützlich, um die Bildung der hämatopoetischen/lymphatischen Organe, nämlich den Thymus5untersuchen. Da die Wachteln mit der Orgel Rudiment explant veredelt im Huhn Embryo vor der hämatopoetischen Vorläuferzellen Zelle Kolonisation, entsteht eine Chimäre Thymus mit Huhn Blut übertragbare Vorläuferzellen Wachtel zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zu infiltrieren. Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug, um den Beitrag der hämatopoetischen Zellen in der Entwicklung des Aviären Hämato/lymphatischen Systems zu erkunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wesentlicher Aspekt für den Erfolg dieser Methode ist die Qualität der Hühner und Wachteln Eier. In Anbetracht der langen Inkubationszeiten, besonders während der in Ovo Test, eine gute Qualität von Hühnereiern verbessert Preise Lebensfähigkeit (bis zu 90 %) durch das Ende des Verfahrens. Um dies zu erreichen, Eier von verschiedenen Herstellern zu testen. Brüten unmanipuliertes Eier über einen längeren Zeitraum (bis zu 16-17 Tage) und ihre Entwicklung zu überprüfen. Um eine gute Qualität-Charge …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind António Cidadão, Isabel Alcobia und Leonor Parreira dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Padma Akkapeddi für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia zufügen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop ausgestattet mit video-System und Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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