शोरबा Microdilution इन विट्रो स्क्रीनिंग: नई रोधी यौगिकों का पता लगाने के लिए एक आसान और तेजी से विधि
Summary
रोधी यौगिकों और अर्क स्क्रीनिंग के लिए एक आसान और अनुकूलनीय शोरबा microdilution विधि ।
Abstract
फंगल संक्रमण पिछले दशकों में एक महत्वपूर्ण चिकित्सा शर्त बन गए हैं, लेकिन उपलब्ध रोधी दवाओं की संख्या सीमित है । इस परिदृश्य में, नई रोधी दवाओं के लिए खोज आवश्यक है । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट विवरण एक विधि उनके रोधी संपत्तियों के लिए पेप्टाइड्स स्क्रीन करने के लिए । यह नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) M27 से शोरबा microdilution संवेदनशीलता परीक्षण पर आधारित है, संशोधन के साथ A3 दिशानिर्देश के लिए संभावित नई रोधी के रूप में रोगाणुरोधी पेप्टाइड के अनुसंधान के अनुरूप है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कार्यात्मक परख के लिए रोधी यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन और आसानी से जांच के तहत अणुओं के किसी विशेष वर्ग के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । के बाद से परख ९६ में प्रदर्शन कर रहे है अच्छी तरह से छोटी मात्रा का उपयोग कर प्लेटें, एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग समय की एक छोटी राशि में पूरा किया जा सकता है, खासकर यदि एक स्वचालन सेटिंग में बाहर ले । इस प्रक्रिया को दर्शाता है कि कैसे एक मानकीकृत और समायोज्य नैदानिक प्रोटोकॉल मदद कर सकता बेंच-नए अणुओं के काम की खोज कवक रोगों की चिकित्सा में सुधार करने के लिए ।
Introduction
फंगल संक्रमण हाल के दशकों में एक महत्वपूर्ण चिकित्सा चिंता का विषय बन गए हैं, काफी मुख्य रूप से प्रतिरक्षा व्यक्तियों की संख्या में वृद्धि के कारण ऐसे कैंसर के इलाज के दौर से गुजर उन लोगों के रूप में और एचआईवी के साथ रहने वाले लोगों/ प्रत्यारोपण अंगों1,2। हालांकि, उपलब्ध रोधी दवाओं की एक बहुत ही सीमित सरणी और कवक प्रतिरोध पर रिपोर्टों की बढ़ती संख्या के लिए उंहें प्रणालीगत mycoses के चिकित्सकीय के बारे में प्रमुख समस्याओं के लिए योगदान3।
नई रोधी यौगिकों के एक संभावित स्रोत रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs), छोटे cationic के लिए अपनी जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भाग के रूप में कई जीवों द्वारा उत्पादित पेप्टाइड्स है4संक्रमण. फिर भी, जांच विधि कवक रोगजनकों के खिलाफ इन यौगिकों का परीक्षण करने के लिए मानकीकृत नहीं है । विभिन्न प्रक्रियाओं AMPs के रोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, कभी-कभार एक ही मॉडल के लिए5,6,7. इन मतभेदों और कुछ प्रोटोकॉल में विस्तार की कमी यौगिकों और बाधा reproducibility के बीच तुलना जटिल ।
नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) M27-A3 दिशानिर्देश जैसे नैदानिक सेटिंग में रोधी संवेदनशीलता को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए गए दिशानिर्देशों का पालन करने के लिए नए दवा उंमीदवारों के परीक्षण का मानकीकरण करने का एक तरीका है । हालांकि, इन रोधी संवेदनशीलता परीक्षण भी प्रतिबंधात्मक हैं, और नहीं ले प्रजातियों के पार चयापचय में भिंनता को ध्यान में रखते हैं, के रूप में वे केवल कुछ चुनिंदा एजेंटों के लिए स्थापित किया गया । उदाहरण के लिए, वे खाते में गैर-किण्वित खमीर के चयापचय की जरूरत नहीं ले ।
इस प्रोटोकॉल भावी रोधी यौगिकों की गतिविधि के आकलन की अनुमति देता है, और यहां रोधी पेप्टाइड्स के लिए खोज के लिए लागू है । यह CLSI M27 से शोरबा microdilution संवेदनशीलता परीक्षण पर आधारित है कि संशोधनों के साथ A3 दिशानिर्देश है कि नए यौगिकों8,9की स्क्रीनिंग का अनुकूलन । इन परिवर्तनों यौगिक की छोटी मात्रा के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं, तापमान या प्रारंभिक इनोक्युलम में बदलाव, और इष्टतम पूर्व परीक्षण के विकास के लिए अलग मीडिया, जबकि नियंत्रण के रूप में संदर्भ रोधी के उपयोग के साथ परिणामों का मानकीकरण । इस विधि, बहु के उपयोग के साथ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें, यह संभव बनाता है जल्दी और मज़बूती से यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन ।
अपने निहित लचीलेपन के कारण, इस प्रोटोकॉल यौगिकों के विभिन्न रासायनिक वर्गों और अन्य सूक्ष्मजीवों के खिलाफ के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, कुछ रूपांतरों के साथ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution परीक्षण यौगिक की छोटी मात्रा का उपयोग कर एक लक्ष्य यौगिक की संभावित रोधी गतिविधि का विश्लेषण कर सकते हैं, और एक ही समय में यह सांद्रता की एक श्रेणी में परीक्षण. तदनुसार, इस प्रोटोकॉल संभावित नए रोध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम CAPES का शुक्र है-ब्राजील, CNPq-ब्राजील, FAP/ हम पांडुलिपि के पुनरीक्षण के लिए डॉ ह्यूगो कोस्टा पेस के आभारी हैं ।
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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