Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos
Summary
Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.
Abstract
Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.
Introduction
Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas3.
Uma potencial fonte de novos compostos antifúngicos são peptídeos antimicrobianos (AMPs), pequenos peptídeos catiônicos produzidos por muitos organismos como parte de sua resposta imune inata para infecção4. No entanto, o método de triagem para testar estes compostos contra patógenos fúngicos não é padronizado. Diferentes procedimentos têm sido utilizados para avaliar a atividade antifúngica de AMPs, às vezes para o mesmo modelo microorganismo5,6,7. Essas diferenças e a falta de detalhes em alguns protocolos complicam comparações entre compostos e dificulta a reprodutibilidade.
Uma forma de padronizar os testes de novos candidatos a fármacos é seguir diretrizes usadas para definir a susceptibilidade em ambientes clínicos, tais como o clínico e orientações Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. No entanto, estes testes de sensibilidade antifúngica são demasiado restritivas e não leva em variação de consideração no metabolismo em toda a espécie, como eles foram criados apenas para alguns agentes selecionados. Por exemplo, eles não levam em conta as necessidades metabólicas de leveduras não-fermentação.
Este protocolo permite a avaliação da atividade dos compostos antifúngicos em potencial e é implementado aqui para a procura de peptídeos antifúngicos. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações CLSI M27-A3 com modificações que otimizam a exibição de novos compostos8,9. Estas alterações permitem o uso de pequenas quantidades de composto, variações de temperatura ou inóculo inicial e de diferentes meios de comunicação para o crescimento ideal do pré-teste, enquanto padronizar os resultados com o uso de antifúngicos de referência como controles. Esse método, com o uso de placas de cultura multi bem, torna possível para um grande número de compostos de tela de forma rápida e confiável.
Devido à sua flexibilidade inerente, este protocolo pode ser usado com diferentes classes químicas de compostos e contra outros microorganismos, com algumas adaptações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a CAPES-Brasil, Brasil-CNPq, FAP/DF para apoio financeiro. Nós estamos gratos ao Dr. Hugo Costa Paes para a revisão do manuscrito.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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