Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Summary

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D₂₃]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSCs) están presentes en una variedad de tejidos y puede diferenciarse en numerosos tipos celulares, incluyendo osteoblastos. Entre las fuentes dentales de MSCs, el periostio es un tejido fácilmente accesible, que se ha identificado a contener MSCs en la capa de cambium. Sin embargo, esta fuente no todavía sido ampliamente estudiada.

Vitamina D₃ y 1,25-(OH)₂D₃ se han demostrado para estimular en vitro la diferenciación de MSCs en osteoblastos. Además, la vitamina C facilita crecimiento de colágeno formación y hueso celular. Sin embargo, ningún estudio ha investigado aún los efectos de la vitamina D₃ y la vitamina C en MSCs.

Aquí, presentamos un método de aislamiento MSCs de periostio alveolar humano y examinar la hipótesis de que 1,25-(OH)₂D₃ puede ejercer un efecto Osteoinductor en estas células. También investigar la presencia de MSCs en el periostio alveolar humano y evaluar proliferación y adhesión de la célula de vástago. Para evaluar la capacidad de la vitamina C (como control) y diferentes concentraciones de 1,25-(OH)₂D₃ (10⁻¹⁰10⁻⁹, 10⁻⁸y 10⁻⁷ M) a alterar clave biomarcadores de mRNA en la expresión del mRNA de MSCs aislada de la fosfatasa alcalina (ALP), ósea sialoprotein (BSP), atascamiento de la base del factor alfa-1 (CBFA1), colágeno-1 y osteocalcina (OCN) se calculan utilizando la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR).

Introduction

Aunque se han desarrollado numerosas técnicas relevantes en los últimos años, los huesos restos de reconstrucción limitada por restricciones múltiples y estimar que el grado de reconstrucción necesaria es a menudo imposible. Aumento de tejido duro es necesaria para alcanzar objetivos estéticos y funcionales además de una tasa de éxito a largo plazo favorable. Métodos comúnmente utilizados para estos procedimientos incluyen injerto óseo autógeno y alógeno, xenografting y el injerto de hueso de alloplastic. Entre los distintos tipos de injerto óseo, injertos de hueso autógeno se consideran los más efectivos. Sin embargo, morbosidad del sitio donante, vascularización comprometida y de la disponibilidad limitada de tejido¹ han sido grandes inconvenientes para el injerto de hueso autógeno. Además, injertos óseos alógenos y xenoinjertos se han asociado con la transmisión de la enfermedad. En la actualidad, injertos óseos sintéticos son ampliamente utilizados para resolver estos problemas. Sin embargo, con su falta de potencial osteogénico, los resultados clínicos han variado ampliamente. Materiales como la celulosa están asociados con fluctuaciones de volumen, infección y la falta de fuerza.

Aumento óseo mediante ingeniería de tejidos ha generado considerable interés. En esta técnica, las células madre mesenquimales (MSCs) se utilizan inicialmente para promover la diferenciación de osteoblastos, que luego se trasplantan al sitio de la pérdida ósea para lograr la reparación del hueso. Este procedimiento se aplica actualmente en terapia celular. Lograr la reconstrucción del hueso mediante la extracción de una cantidad limitada de tejido es más simple y menos invasivo en comparación con otros métodos.

El papel potencial de MSCs como una herramienta para las terapias basadas en células para regeneración dental es un emergente interés entre varios grupos de investigación. Estudios han confirmado que MSCs pueden ser distinguidos de los siguientes tipos de tejidos: médula ósea, membrana sinovial adiposa, pericyte, hueso trabecular, cordón umbilical humano y tejidos dentales^2,3. Fuentes comunes de MSCs incluyen médula ósea, tejido adiposo y los tejidos dentarios. En comparación con MSCs derivadas de tejido adiposo y la médula ósea, las ventajas de células madre dentales son de fácil accesibilidad y menor morbilidad después de la cosecha. En comparación con las células madre embrionarias, MSCs derivados de tejido dental aparecen nonimmunogenic y no se asocian a problemas éticos complejos³.

En 2006, la sociedad internacional de terapia celular recomendado utilizando los siguientes estándares para identificar MSCs: en primer lugar, MSCs deben ser capaces de unir al plástico. En segundo lugar, MSCs deben ser positivas para los antígenos de superficie de CD105 y CD73, CD90 y negativa para los marcadores de monocitos, macrófagos y células B además de las hematopoyéticos antígenos CD45 y CD34⁴. Como criterio final, MSCs deben ser capaces de distinguir en los siguientes tres tipos de células en condiciones normales de diferenciación en vitro : osteoblastos, adipocitos y condrocitos⁴. Hasta la fecha, seis tipos de células madre dentales humanas han sido aislados y caracterizados. El primer tipo fue aislado de tejido pulpar humano y había denominado células madre de pulpa dental postnatal⁵. Posteriormente, se han aislado y caracterizado tres tipos adicionales de MSCs dentales: células madre de dientes de hojas caducas exfoliada⁶, el ligamento periodontal⁷y la papila apical⁸. Más recientemente, deriva del folículo dental⁹, derivados del tejido gingival¹⁰, brote dental madre cells(DBSCs)¹¹y quiste periapical MSCs (hPCy-MSCs)¹² se también han identificado.

Friedenstein fue el primero en definir MSCs¹³. MSCs presentan una alto potencial de proliferación y pueden manipularse para diferenciar antes de ser trasplantado, lo cual sugiere que son candidatos ideales para procedimientos regenerativos¹⁰.

Aunque la mayoría de los estudios ha utilizado la médula ósea como fuente de células madre, células derivadas del periostio (PDC) también han sido utilizados recientemente¹⁴. El periostio es más fácilmente accesible que es la médula ósea. Por lo tanto, en esta técnica, utilizamos periostio alveolar para eliminar la necesidad de incisiones adicionales durante la cirugía y para reducir la morbilidad postquirúrgica en los pacientes. El periostio es el tejido conectivo que forma el revestimiento exterior de los huesos largos y se compone de dos capas distintas: la capa fibrosa externa compuesta de fibroblastos, colágeno y fibras elásticas¹⁵y la capa interior de t-célula-rico de cambium en contacto directo con la superficie del hueso. La capa de cámbium contiene una población de células mixta, principalmente fibroblastos¹⁶, osteoblastos¹⁷, del pericitos¹⁸y una subpoblación crítico identificado como MSCs^19,20,21. Mayoría de los estudios ha reportado que PDC es comparable, si no superior, a células madre procedentes de médula ósea (bMSCs) en hueso curativo y regeneración^22,23,24. El periostio es fácilmente accesible y exhibe excelente eficacia regenerativa. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en el periostio^25,26,27.

Con respecto a la reparación del hueso, la práctica clínica actual consiste en el trasplante de células progenitoras perióstica amplificado en andamios de apoyo. Estudios recientes se han centrado en la adquisición de células madre en regiones defectuosas y empleando células progenitoras para regeneración de tejido²⁰. Los dentistas también anticipan futuro aplicación de regeneración periodontal del hueso en tratamientos periodontales e implantes dentales. Con respecto al sitio donador, el periostio puede ser cosechado fácilmente por odontólogos generales. Esto se compara favorablemente contra células estromales de la médula ósea, como el periostio puede accederse durante cirugía bucal rutinaria. Así, el objetivo de este estudio es establecer un protocolo para la recolección de PDC y evaluar la morfología, accesorio, viabilidad y proliferación de las células madre humanas de periostio.

Metabolitos de vitamina D afectan en vivo mineral óseo equilibrio dinámico. Un estudio informó que la 24R,25-(OH)_{3 2}D forma activa de vitamina D es esencial para la diferenciación osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)²⁸. Homeostasis del hueso y la reparación son reguladas por una red de metabolitos de vitamina D₃ , de que 1,25-(OH)₂D₃ (calcitriol) es biológicamente más activo y relevante en la regulación de la salud de los huesos. Vitamina D₃ es esencial para la calcificación²⁹. En un estudio utilizando ratones de Kunming blanco de 2-d de edad, los cuerpos de embryoid en los ratones indican que suplementos de vitamina C y vitamina D promovieron eficazmente la diferenciación de osteoblastos derivados de ESC³⁰. Entre sus otras actividades biológicas, 1,25-(OH)₂D₃ estimula la diferenciación en vitro de hMSCs a osteoblastos, que pueden ser monitoreados basados en el incremento en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (ALP) o gen de la OCN expresión.

Algunos estudios han detectado una relación dosis-respuesta de los tratamientos combinados con vitamina C y 1,25-(OH)₂D₃ en PDC humana con un enfoque particular en la ingeniería de tejido óseo. Por lo tanto, en este estudio, examinamos la concentración óptima para el tratamiento único o combinado de 1,25-(OH)₂D₃ y la vitamina C para inducir la diferenciación osteogénica de PDC humana. El objetivo de este protocolo es determinar si una población de células aislada del periostio alveolar dental contiene células con un fenotipo MSC y si estas células pueden ser ampliadas en la cultura (en vitro) y distinguidas para formar el tejido deseado . Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos. La segunda parte del estudio evalúa los efectos de la vitamina C y 10⁻¹⁰10⁻⁹, 10⁻⁸y 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ en la actividad osteogénica del PDC. El objetivo principal de este estudio es evaluar las funciones de la vitamina C y 1,25-(OH)₂D₃ durante la diferenciación osteoblástica de PDC por actividad de la ALP y genes pro-osteogénicos, como ALP, colágeno 1, OCN, BSP y CBFA1. Además, este estudio determina las condiciones de óptimo osteoinductores para humano PDC basado en estos resultados.

Protocol

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. 1. preparación de tejido Cosechan los tejidos periósticos de pacientes durante una cirugía dental (figura 1). Después de la reflexión de la aleta bajo anestesia local, tome un pedazo de tejido del periostio del hueso alveolar utilizando un separador perióstico de<sup class="…

Representative Results

Para los ensayos cuantitativos, los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante de Student t-test. En total, se obtuvieron 34 muestras con una edad media de participantes de 48,1 ± 12,3 y once de estas muestras se obtuvieron de pacientes masculinos y 23 pacientes femeninos. Se obtuvieron muestras de veinte y ocho de las regiones molares y de seis de las regiones anteriores; 26 se obtuvieron de la maxila y …

Discussion

Una modalidad terapéutica desarrollada recientemente, es decir, recreando el tejido del que implique MSCs, tiene numerosas ventajas. MSCs, que están presentes en varios tipos de tejidos, son células pluripotentes que pueden diferenciarse en una variedad de células de tejidos mesodérmicos funcionales³⁷ y otras células como los osteoblastos.

El periostio sirve como un nicho para las células del progenitor y como una fuente de rica vasculatura para el hueso envuelve…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt	Sigma	49752
35-mm culture dishes	Corning	430165
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
6  well plate	Corning	3516
Alkaline phosphatase	ABI	Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit	BioVision	K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase	Roche	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
Cell banker1	ZEAOAQ	11888
core binding factor alpha-1	ABI	Hs00231692_m1
dexamethasone	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
indomethacin	Sigma	I7378
insulin	sigma	91077C
insulin–transferrin–selenium-A	Sigma	I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)	Life	4346907
MicroAmp optical adhesive film	Life	4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification	HyClone	SH30265.02
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Permeabilization buffer	eBioscience	00-8333-56
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	Life	4304437
transforming growth factor-β	Sigma	T7039
Trizol reagent (for RNA isolation)	Life	15596018
β-glycerophosphate	Sigma	G9422
collagen-1	Invitrogen	forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
		reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
		reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP	Invitrogen	forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
		reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers