Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio
Summary
Vi presentiamo un protocollo per studiare i biomarcatori di espressione di mRNA di cellule derivanti dal periostio (PDC) indotte da vitamina C (vitamina C) e 1,25-diidrossi-vitamina D [1,252D-3]. Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC.
Abstract
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono presenti in una varietà di tessuti e possono essere differenziate in numerosi tipi cellulari, tra cui osteoblasti. Tra le fonti dentale di MSCs, il periostio è un tessuto facilmente accessibile, che è stato identificato per contenere MSCs nello strato cambiale. Tuttavia, questa fonte non è stato ancora ampiamente studiata.
Vitamina D3 e 1,252D-3 hanno dimostrati di stimolare la differenziazione in vitro di cellule staminali mesenchimali in osteoblasti. Inoltre, vitamina C facilita la crescita di collagene dell’osso e la formazione delle cellule. Tuttavia, nessuno studio ha ancora studiato gli effetti della vitamina D3 e la vitamina C su MSCs.
Qui, presentiamo un metodo per isolare MSCs dal periostio alveolare umano ed esaminare l’ipotesi che 1,25-2D3 può esercitare un effetto osteoinduttivo su queste cellule. Abbiamo anche indagare la presenza di cellule staminali mesenchimali nel periostio alveolare umano e valutare la proliferazione e l’adesione delle cellule staminali. Per valutare la capacità della vitamina C (come controllo) e le varie concentrazioni di 1,252D-3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) di alterare biomarcatori chiave di mRNA in l’espressione del mRNA di MSCs isolato della fosfatasi alcalina (ALP), osso sialoproteina (BSP), associazione nucleo fattore alfa-1 (CBFA1), collagene-1 e osteocalcina (OCN) sono misurati usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR).
Introduction
Anche se negli ultimi anni sono state sviluppate numerose tecniche pertinenti, osso resti ricostruzione limitata da vincoli multipli e stimare che l’entità della ricostruzione necessaria è spesso impossibile. L’incremento dei tessuti duri è necessaria per raggiungere obiettivi sia estetici che funzionali, oltre a un tasso di successo a lungo termine favorevole. Metodi comunemente usati per tali procedure includono l’innesto dell’osso autologo e allogenico trapianto xenogenico e l’innesto dell’osso di alloplastic. Tra i vari tipi di innesto osseo, innesti di osso autologo sono considerati il più efficace. Tuttavia, la morbilità del sito donatore, vascolarizzazione compromessa e tessuto limitata disponibilità1 sono stati gravi inconvenienti per l’innesto di osso autologo. Inoltre, gli innesti dell’osso allogenico e gli xenotrapianti sono stati associati con la trasmissione della malattia. Attualmente, gli innesti di osso sintetico sono ampiamente utilizzati per risolvere questi problemi. Tuttavia, con la loro mancanza di potenziale osteogenico, i risultati clinici hanno variato ampiamente. Materiali quali cellulosa sono associati con fluttuazione di volume, infezione e una mancanza di forza.
Aumento osseo mediante ingegneria tissutale ha suscitato notevole interesse. In questa tecnica, cellule staminali mesenchimali (MSCs) vengono inizialmente utilizzate per promuovere la differenziazione degli osteoblasti, che sono poi trapiantati al sito di perdita dell’osso per ottenere riparazione ossea. Questa procedura è attualmente applicata nella terapia cellulare. Raggiungimento di ricostruzione ossea tramite l’estrazione di una quantità limitata di tessuto è più semplice e meno invasivo rispetto ad altri metodi.
Il ruolo potenziale di cellule staminali mesenchimali come uno strumento per le terapie basate sulle cellule mirate alla rigenerazione dentale è un crescente interesse tra i vari gruppi di ricerca. Gli studi hanno confermato che MSCs possono essere differenziati dai seguenti tipi di tessuto: midollo osseo, membrana sinoviale, adiposa, Pericita, trabecular dell’osso, del cordone ombelicale umano e tessuti dentali2,3. Fonti comuni di MSCs includono del midollo osseo, tessuto adiposo e tessuti dentali. Rispetto con MSCs derivate dal tessuto adiposo e midollo osseo, i vantaggi delle cellule staminali dentali sono di facile accessibilità e meno morbosità dopo la raccolta. Confrontato con le cellule staminali embrionali, MSCs derivate da tessuto dentale appaiono nonimmunogenic e non sono associati a preoccupazioni di ordine etico complesso3.
Nel 2006, l’International Society for Cellular Therapy consigliato utilizzando i seguenti standard per identificare MSCs: in primo luogo, è necessario che i MSCs sia in grado di associare alla plastica. In secondo luogo, è necessario che MSCs sia positiva per gli antigeni di superficie CD105, CD73 e CD90 e negativo per i marcatori per i monociti, macrofagi e cellule di B oltre alla ematopoietici antigeni CD45 e CD344. Come criterio finale, MSCs deve essere in grado di differenziarsi nei seguenti tre tipi di cellule in condizioni standard di differenziazione in vitro : osteoblasti, adipociti e condrociti4. Fin qui, sei tipi di cellule staminali dentali umane sono stati isolati e caratterizzati. Il primo tipo è stato isolato dal tessuto umano della polpa e definito di cellule staminali della polpa dentale postnatale5. Successivamente, ulteriori tre tipi di MSCs dentale sono stati isolati e caratterizzati: cellule staminali da denti decidui esfoliate6, il legamento parodontale7e la papilla apicale8. Più recentemente, derivato dal follicolo dentale9, gengivale tessuto-derivato10, germe dentale staminali cells(DBSCs)11e ciste periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 inoltre sono stati identificati.
Friedenstein fu il primo a definire MSCs13. MSCs esibiscono un’alta potenziale di proliferazione e può essere manipolato per differenziare prima di essere trapiantate, il che suggerisce che sono candidati ideali per procedure rigenerative10.
Anche se la maggior parte degli studi hanno utilizzato midollo osseo come fonte di cellule staminali, cellule derivanti dal periostio (PDC) sono stati anche recentemente utilizzata la dimensione14. Il periostio è più facilmente accessibile del è il midollo osseo. Pertanto, in questa tecnica, utilizziamo periostio alveolare per eliminare la necessità di ulteriori incisioni durante l’intervento chirurgico e per ridurre la morbosità postsurgical in pazienti. Il periostio è il tessuto connettivo che forma il rivestimento esterno delle ossa lunghe e comprende due strati distinti: lo strato fibroso esterno composto da fibroblasti, collagene e fibre elastiche15e lo strato interno cellula-ricco cambiale a diretto contatto con la superficie dell’osso. Lo strato cambiale contiene una popolazione di cellule miste, soprattutto fibroblasti16, osteoblasti17, periciti18e una sottopopolazione critica identificati come MSCs19,20,21. Maggior parte degli studi hanno segnalato che PDC sono paragonabili, se non superiore, a cellule staminali derivate da midollo osseo (BMSC) in osso guarigione e rigenerazione22,23,24. Il periostio è facilmente accessibile ed esibisce eccellente efficacia rigenerativa. Tuttavia, pochi studi hanno messo a fuoco il periostio25,26,27.
Per quanto riguarda la riparazione ossea, l’attuale pratica clinica coinvolge il trapianto di cellule progenitrici periosteal amplificato all’interno di impalcature di sostegno. Recenti studi hanno messo a fuoco su acquisizione di cellule staminali nelle regioni difettose e che impiegano cellule progenitrici per tessuto rigenerazione20. Dentisti anche anticipano la futura applicazione di rigenerazione ossea parodontale in trattamenti parodontali e impianti dentali. Per quanto riguarda il sito donatore, il periostio può essere facilmente raccolto dai chirurghi dentali generali. Ciò paragona favorevole contro le cellule stromali del midollo, come il periostio può accedervi durante intervento chirurgico orale di routine. Così, l’obiettivo di questo studio è di stabilire un protocollo per la raccolta del PDC e di valutare la morfologia, attaccamento, vitalità e proliferazione di cellule staminali umane periostio.
I metaboliti della vitamina D influenzano l’equilibrio dinamico in vivo minerale ossea. Uno studio ha riferito che il 24R,25-(OH)2D3 forma attiva della vitamina D è essenziale per la differenziazione osteoblastica di umano MSCs (hMSCs)28. Omeostasi dell’osso e riparazione sono regolati da una rete di metaboliti di vitamina D3 , di cui 1,252D3 (calcitriol) è il più biologicamente attivo e rilevante nella regolazione della salute dell’osso. Vitamina D3 è essenziale per la calcificazione29. In uno studio facendo uso dei topi di Kunming bianco 2-d-vecchi, i corpi embryoid nei topi hanno indicato che i supplementi di vitamina D e vitamina C efficacemente promossa la differenziazione degli osteoblasti derivati ESC30. Tra le sue altre attività biologiche, 1,25-2D3 stimola la differenziazione in vitro di hMSCs di osteoblasti, che possono essere monitorati basati sull’aumento nell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina (ALP) o OCN gene espressione.
Pochi studi hanno rilevato una relazione dose-risposta di trattamenti combinati con vitamina C e 1,252D3 nell’umano PDC con un focus particolare sull’ingegneria del tessuto osseo. Pertanto, in questo studio, esaminiamo le concentrazioni ottimale per il trattamento singolo o combinato di 1,252D-3 e vitamina C per l’induzione del differenziamento osteogenico di PDC umano. L’obiettivo del presente protocollo è quello di determinare se una popolazione di cellule isolata dal periostio alveolare dentale contiene cellule con un fenotipo MSC e se queste cellule possono essere espanse in coltura (in vitro) e differenziate per formare il tessuto desiderato . Inoltre, valutiamo la capacità di differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti PDC. La seconda parte dello studio valuta gli effetti di vitamina C e 10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M 1,25-2D3 sull’attività osteogenica del PDC. L’obiettivo primario di questo studio è di valutare le funzioni di vitamina C e2D 1,25-3 durante la differenziazione osteoblastica di PDC da attività ALP e geni pro-osteogenico, come ALP, collagene-1, OCN, BSP e CBFA1. Inoltre, questo studio determina le condizioni ottimali osteoinduttivo per PDC umano sulla base di questi risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una modalità terapeutica sviluppata di recente, vale a dire che comportano MSCs, di ingegneria tissutale ha numerosi vantaggi. MSC, che sono presenti in diversi tipi di tessuto, sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in una varietà di tessuti mesodermal funzionale cellule37 e altre cellule quali osteoblasti.
Il periostio serve come una nicchia per cellule progenitrici e come un rifornimento ricco sistema vascolare per l’osso che avvolge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il protocollo di studio è stato approvato da Institutional Review Board per clinica ricerca di Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B e C 103-4223). Questo studio è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Questo manoscritto è stato modificato da Wallace accademico Editing.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
| 35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
| Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
| avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| indomethacin | Sigma | I7378 | |
| insulin | sigma | 91077C | |
| insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
| MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
| Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
| transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
| reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
| OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
| reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
| BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
| reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
| Commercial ALP primers | |||
| Commercial CBFA1 primers |
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