כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea
Summary
Planarian Schmidtea התיכון ונמצא היא דוגמנית מעולה ללימוד בתאי גזע והתחדשות רקמות. פרסום זה מתאר שיטה להסרת איבר אחד, הלוע, באופן סלקטיבי על ידי חשיפת לבעלי חיים אזיד הנתרן כימי. פרוטוקול זה גם מתאר שיטות לניטור הלוע התחדשות.
Abstract
Planarians הם תולעים שטוחות כי הם מאוד יעילים התחדשות. הם חייבים את היכולת הזאת מספר גדול של תאי גזע יכולים להגיב במהירות לכל סוג של פגיעה. דגמים נפוצים פגיעה בבעלי חיים אלה להסיר כמויות גדולות של רקמות, אשר פוגעת באיברים רבים. כדי להתגבר על הנזק רקמות רחב, נתאר כאן שיטה להוציא איבר יחיד, הלוע, planarian Schmidtea התיכון ונמצאבאופן סלקטיבי. נוכל להשיג זאת על ידי השריית החיות בתמיסה המכילה את אזיד הנתרן מעכב ציטוכרום אוקסידאז. חשיפה קצרה אזיד הנתרן גורמת ההבלטה של הלוע של החיה, שאנו מכנים “כימי קטיעה.” קטיעה כימי מסיר הלוע כולו, ויוצרת פצע קטן שבו הלוע מייחסת המעי. לאחר שטיפה נרחב, כל החיות הקטוע להתחדש הלוע באופן תקין לחלוטין בעוד כשבוע. תאי גזע בשאר חלקי הגוף כונן התחדשות של הלוע החדש. כאן, אנו מספקים מפורטת פרוטוקול עבור קטיעה כימי, ולתאר היסטולוגית והתנהגותיים שיטות להערכת קטיעה מוצלחת והתחדשות.
Introduction
התחדשות היא תופעה המתרחשת בכל רחבי ממלכת החי, עם יכולות משובי החל גוף מלא התחדשות של חסרי חוליות מסוימים ליכולות מוגבל יותר חוליות1. החלפת רקמות פונקציונלי הוא תהליך מורכב, לעתים קרובות כרוך שיקום בו זמנית של מספר סוגי תאים. לדוגמה, לחדש את האיבר סלמנדרה תאי העצם, chondrocytes, נוירונים, השרירים, לתאי האפיתל צריך להיות מוחלף2. אלה סוגי תאים החדש שנוצר גם צריך להיות מאורגן כראוי כדי להקל על תפקוד האיבר החדש. הבנת התהליכים המורכבים האלה דורשת טכניקות להתמקד התחדשות של סוגי תאים מסוים ואת השתלבותם איברים.
אחת האסטרטגיות מועסק כדי לפשט את המחקר של תגובות רגנרטיבית היא אבלציה יישוב של או תא סוגים מסוימים או אוספים גדולים של רקמות. לדוגמה, בדג זברה, ביטוי של nitroreductase סוגי תאים ספציפיים שמוביל את ההרס שלהם לאחר היישום של מטרונידזול3,4. בדרוזופילה הזחלים, ביטוי גנים פרו-אפופטוטיים להיפגע תחת היזמים רקמות ספציפיות יכול באופן סלקטיבי ablate אזורים ספציפיים של דמותי דיסק5,6. של אסטרטגיות אלו גורמים נזק מהיר אך מבוקרת, והן שימשו כדי לנתח את המנגנונים המולקולריים הסלולר אחראי על התחדשות.
כתב יד זה, אנו מתארים שיטה באופן סלקטיבי ablate איבר שלם שנקרא הלוע planarian התיכון ונמצא Schmidtea. Planarians הם מודל קלאסי של התחדשות, ידועה פורה הרגנרציה שלהם, שבו שברי אפילו דקה ניתן לשחזר חיות כל 7,8. יש להם אוכלוסיה גדולה, הטרוגניות של תאי גזע המורכב תאים pluripotent והן מוגבלת לשושלת אבות9,10,11. תאים אלה להתרבות, להבדיל להחלפת רקמות חסרות כל, כולל את הלוע, מערכות עצבים, עיכול, excretory, שרירים ו בתאי אפיתל9,10,12. בזמן שאנו יודעים כי אלה בתאי גזע ליזום התחדשות, נעשה לא לגמרי להבין את המנגנונים המולקולריים להסיע אותם כדי להחליף את כל סוגי התאים הללו. שיטות ופצעו מוגדרת זה להפיק תאי גזע מדויק תגובות יכול לעזור ניסחו את התהליך המורכב הזה.
הלוע הוא צינור גדול, גלילי הדרושים עבור האכלה, מכיל נוירונים, שריר, תאי אפיתל, הפרשה13,29. בדרך כלל מוסתרים בתוך תיק. על הצד הבטני של החיה, זה מרחיב דרך גוף יחיד החיה פתיחה על חישת הנוכחות של מזון. כדי לקטוע באופן סלקטיבי הלוע, אנחנו להשרות planarians אזיד הנתרן שנקרא כימי, הרדמה נפוץ ב- C. elegans14,15,16. השימוש בו planarians דווחה לראשונה על ידי אדלר et al., ב- 201412. תוך דקות של חשיפה אזיד הנתרן, planarians ‘ הבלטת ממד ‘ pharynges שלהם, עם עצבנות עדין, הלוע לניתוק מהחיה. אנחנו מתייחסים לירידה זו בררני ושלמה של הלוע כמו “קטיעה כימי”. שבוע לאחר קטיעה, הלוע תקינים הוא משוחזר12. מאחר הלוע נדרש האכלה, התחדשות פונקציונלי נמדד על ידי פיקוח על התנהגות האכילה. בהמשך נתאר את הפרוטוקול על קטיעה כימיים ועל הערכת לרגנרציה של הלוע ושיקום של האכלה התנהגות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה של אבלציה סלקטיבי של הלוע באמצעות אזיד הנתרן. מחקרים אחרים אבלציה יישוב ב- planarians השתמשו ניתוח שונה כדי להסיר photoreceptors21 או טיפול תרופתי כדי ablate נוירונים דופאמין22. יתרון משמעותי אחד של קטיעה כימי על שיטות קיימות היא כי זה אינו מחייב ניתוח. מבנה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אלחנדרו Sánchez אלברדו, שתמכו את אופטימיזציה הראשונית והפיתוח של טכניקה זו. העבודה במעבדה של קרולין אדלר נתמך על ידי אוניברסיטת קורנל ראשונית.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
