रासायनिक विच्छेदन और Planarian में ग्रसनी के पुनर्जनन Schmidtea mediterranea
Summary
planarian Schmidtea mediterranea स्टेम सेल और ऊतक पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । इस प्रकाशन के चुनिंदा एक अंग हटाने के लिए एक विधि का वर्णन है, ग्रसनी, रासायनिक सोडियम azide के लिए जानवरों को उजागर करके. इस प्रोटोकॉल भी ग्रसनी पुनर्जनन की निगरानी के लिए तरीकों की रूपरेखा ।
Abstract
Planarians flatworms हैं जो उत्थान में अत्यंत दक्ष हैं. वे स्टेम सेल की एक बड़ी संख्या है कि तेजी से चोट के किसी भी प्रकार का जवाब कर सकते है करने के लिए इस क्षमता देना है । इन जानवरों में आम चोट मॉडल ऊतक है, जो कई अंगों को नुकसान की बड़ी मात्रा को हटा दें । इस व्यापक ऊतक क्षति को दूर करने के लिए, हम यहाँ एक विधि चुनिंदा planarian Schmidtea mediterraneaमें एक ही अंग, ग्रसनी, हटाने के लिए वर्णन. हम cytochrome oxidase अवरोधक सोडियम azide युक्त समाधान में पशुओं को भिगोने के द्वारा इस लक्ष्य को प्राप्त । सोडियम azide के लिए संक्षिप्त जोखिम पशु से ग्रसनी के बाहर निकालना का कारण बनता है, जिसे हम “रासायनिक विच्छेदन” कहते हैं । रासायनिक विच्छेदन पूरे ग्रसनी निकालता है, और एक छोटे से घाव उत्पन्न करता है जहां ग्रसनी आंत के लिए देता है । व्यापक धोने के बाद, सभी विच्छेदित जानवरों लगभग एक सप्ताह में एक पूरी तरह कार्यात्मक ग्रसनी पुनर्जीवित । शरीर के बाकी हिस्सों में स्टेम कोशिकाओं को नए ग्रसनी के पुनर्जनन । यहां, हम रासायनिक विच्छेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और दोनों ऊतकवैज्ञानिक और व्यवहार विधियों का वर्णन करने के लिए सफल विच्छेदन और उत्थान का आकलन ।
Introduction
पुनर्जनन एक घटना है कि पशु किंगडम भर में होता है, कुछ अकशेरूकीय में पूर्ण शरीर पुनर्जनन से रीढ़ में अधिक प्रतिबंधित क्षमताओं को लेकर अपक्षयी क्षमता के साथ1. कार्यात्मक ऊतकों के प्रतिस्थापन एक जटिल प्रक्रिया है और अक्सर एकाधिक कोशिका प्रकार के एक साथ बहाली पर जोर देता है । उदाहरण के लिए, समन्दर का अंग, osteoblasts, chondrocytes, न्यूरॉन्स, मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने के लिए, और उपकला कोशिकाओं को प्रतिस्थापित किया जा करने की आवश्यकता2. इन नव उत्पंन सेल प्रकार भी व्यवस्थित करने के लिए ठीक से नए अंग समारोह की सुविधा की जरूरत है । इन जटिल प्रक्रियाओं को समझना तकनीक है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के उत्थान और अंगों में उनके एकीकरण पर ध्यान केंद्रित की आवश्यकता है ।
एक reअपक्षयी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सरल करने के लिए नियोजित रणनीतियों में से एक या तो कुछ सेल प्रकार या ऊतकों का बड़ा संग्रह के लक्षित पृथक है । उदाहरण के लिए, zebrafish में, विशिष्ट कक्ष प्रकारों में nitroreductase की अभिव्यक्ति metronidazole3,4के अनुप्रयोग के बाद उनके विनाश की ओर ले जाती है । Drosophila लार्वा में ऊतक-विशिष्ट प्रवर्तकों के अधीन समर्थक अपोप्तोटिक जीन व्यक्त कर काल्पनिक डिस्क5,6के विशिष्ट क्षेत्रों को चुनिंदा रूप से ablate कर सकते हैं । इन रणनीतियों के दोनों तेजी से लेकिन नियंत्रित क्षति का कारण है, और आणविक और सेलुलर काटना उत्थान के लिए जिंमेदार तंत्र का इस्तेमाल किया गया है ।
इस पांडुलिपि में, हम चुनिंदा एक पूरे अंग ablate planarian Schmidtea mediterraneaमें ग्रसनी बुलाया एक विधि का वर्णन । Planarians पुनर्जनन के एक शास्त्रीय मॉडल, उनके विपुल अपक्षयी क्षमता के लिए जाना जाता है, जहां भी मिनट टुकड़े पूरे जानवरों को फिर से विकसित कर सकते है 7,8। वे दोनों pluripotent कोशिकाओं और वंश-प्रतिबंधित progenitors9,10,11से मिलकर स्टेम कोशिकाओं की एक बड़ी, विषम जनसंख्या है । इन कोशिकाओं पैदा करना और सभी लापता ऊतकों, ग्रसनी, तंत्रिका, पाचन और निकालनेवाला प्रणालियों, और मांसपेशी और उपकला कोशिकाओं 9, 10, 12 सहित बदलने के लिए अंतर । जबकि हम जानते है कि इन स्टेम सेल पुनर्जनन शुरू, हम पूरी तरह से आणविक तंत्र है कि उंहें ड्राइव इन सभी विभिंन प्रकार के सेल की जगह समझ नहीं है । परिभाषित घायल तरीकों कि सटीक स्टेम सेल की प्रतिक्रियाएं इस जटिल प्रक्रिया चित्रित मदद कर सकते है ।
ग्रसनी एक बड़े, बेलनाकार ट्यूब खिलाने के लिए आवश्यक है, और न्यूरॉन्स, मांसपेशी, उपकला और स्रावी कोशिकाओं13,29शामिल हैं. आम तौर पर जानवर के ventral पक्ष पर एक थैली में छिपा हुआ, यह भोजन की उपस्थिति संवेदन पर जानवर के एकल शरीर खोलने के माध्यम से फैली हुई है । चुनिंदा ग्रसनी विच्छेदन करने के लिए, हम एक रसायन सोडियम azide बुलाया में planarians सोख, एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया संवेदनाहारी में सी. एलिगेंस14,15,16। planarians में इसका इस्तेमाल पहले एडलर एट अल., 201412में द्वारा सूचित किया गया था । सोडियम azide के लिए जोखिम के मिनट के भीतर, planarians अपने pharynges बाहर निकालना, और कोमल आंदोलन के साथ, ग्रसनी जानवर से अलग । हम “रासायनिक विच्छेदन” के रूप में ग्रसनी के इस पूर्ण और चयनात्मक नुकसान का उल्लेख । विच्छेदन के बाद एक सप्ताह, एक पूरी तरह कार्यात्मक ग्रसनी12बहाल कर रहा है । क्योंकि ग्रसनी खिलाने के लिए आवश्यक है, कार्यात्मक पुनर्जनन खिला व्यवहार की निगरानी द्वारा मापा जा सकता है । नीचे, हम रासायनिक विच्छेदन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, और ग्रसनी और खिला व्यवहार की बहाली के उत्थान का आकलन करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल सोडियम azide का उपयोग ग्रसनी के चयनात्मक पृथक की एक विधि का वर्णन । planarians में अंय लक्षित पृथक अध्ययन संशोधित सर्जरी का इस्तेमाल किया है photoreceptors21 या औषधीय उपचार ablate dopaminergic ंयूरॉंस को दूर करन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऐलेजैंड्रो Sánchez Alvarado, जो इस तकनीक के प्रारंभिक अनुकूलन और विकास का समर्थन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । कैरोलिन है एडलर प्रयोगशाला में काम कॉर्नेल विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
