في هذه الدراسة، يصف لنا نظام في ovo كأداة واعدة لاختبار مركبات الأنسولين ميميتيك في حي. وتشمل المزايا الرئيسية معدلات الإنتاجية الكافية وتكاليف مقبولة، والتي تمكن من تحديد هوية المواد الكيميائية النباتية مع خصائص الأنسولين ميميتيك.
مستويات السكر في الدم مرتفعة في نوع 2 السكري (T2DM)، أمراض ايضية المعقدة والمتعددة العوامل، ناجمة عن عدم المقاومة وخلايا بيتا الأنسولين. اتبعت استراتيجيات مختلفة، بما في ذلك حقن الأنسولين أو استخدام المخدرات توعية الأنسولين، لعلاج T2DM أو على الأقل الحد من الأعراض. وبالإضافة إلى ذلك، تطبيق المركبات العشبية وقد اجتذب اهتماما متزايداً. وبالتالي، من الضروري إيجاد نظم اختبار الكفاءة تحديد وتوصيف المركبات الأنسولين ميميتيك. هنا قمنا بتطوير نموذج جنين فرخ معدلة، التي تمكن من اختبار المركبات الاصطناعية ومقتطفات من الأعشاب مع خصائص الأنسولين ميميتيك. استخدام fluorescence المستندة إلى الفحص المجهري شاشة الأولية، التي يوضحها نقل جسد الجلوكوز الناقل 4 (Glut4) لغشاء البلازما، كنا قادرين على تحديد المركبات، أساسا من مستخلصات الأعشاب، التي تؤدي إلى زيادة الجلوكوز داخل الخلايا التركيزات في adipocytes. بيد أن فعالية هذه المواد يتطلب المزيد من التحقق في حي. وهكذا، استخدمنا نهج في ovo إلى التعرف على خصائص خفض جلوكوز الدم. لا تلزم موافقة لجنة أخلاقيات بحيث لا يعتبر استخدام أجنة الدجاج خلال الثلثين الأول من التنمية الجنينية تجربة حيوان. ويرد هنا، تطبيق هذا النموذج بالتفصيل.
السكري من الأمراض ايضية تتميز بارتفاع السكر في الدم، ويحدث بسبب خلل في إفراز الأنسولين أو الأنسولين الإجراء1. تسعين في المئة من جميع حالات السكري هي فئة نوع 2 السكري (T2DM)، التي تظهر فيها الأفراد مقاومة الأنسولين و نقص الأنسولين معظمها2. هناك عدة عوامل معروفة لزيادة انتشار عالمي من T2DM، بما في ذلك التغييرات في نمط الحياة، ولا سيما تلك المتصلة بالإفراط في التغذية، والشيخوخة، والخمول البدني. ما يقرب من 400 مليون شخص بمرض البول السكري في العالم وفقا لاتحاد السكري الدولي (جيش الدفاع الإسرائيلي). هذا العدد من المتوقع أن تصل إلى 600 مليون خلال ال 20 سنة القادمة3.
السكري المضاعفات الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم ومقاومة الأنسولين، مثل ارتفاع ضغط الدم، دسليبيدميا، الجلوكوز التعصب وأمراض القلب والشرايين، وأمراض الأوعية الدموية الدماغية، يؤدي إلى انخفاض كبير متوسط العمر المتوقع ونوعية4. الأفراد المتضررين تتطلب تخفيض مستوى السكر العلاج الصيدلاني؛ ومع ذلك، استخدام المخدرات، مثل الميتفورمين5 وكثيراً ما يرتبط مع آثار جانبية دراماتيكية6،،من78. ولذلك، كذلك ضرورية antidiabetic النهج التي آمنة ومتاحة على نطاق واسع وغير مكلفة.
تم المسند إلى ميزة الأنسولين mimetic خصائص المركبات العشبية المختلفة ومقتطفات، والنباتات، والمغذيات بتحوير الوظائف الخلوية المختلفة. سمة هامة حفز نقل جسد الجلوكوز الناقل 4 (GLUT4) لغشاء البلازما من أماكن تخزين داخل الخلايا، مما أدى استيعاب زيادة الجلوكوز في العضلات والأنسجة الدهنية في غياب الأنسولين، المعروفة باسم إلى خصائص الأنسولين ميميتيك9. في السابق، قمنا بتنفيذ نهج قائم على الفحص المجهري الأسفار التحديد الكمي لعملية نقل جسد GLUT410. وأسفر تحليل للمستخلصات النباتية العديد من مكتبة استخراج11 استخدام هذا الفحص تحديد المرشحين الواعدين. ومع ذلك، تلزم مزيد من الاختبارات في الكائنات الحية. النهج الذي وصف بالتفصيل في هذه الورقة، نموذج جنين فرخ معدلة، ثبت أن تكون نموذجا واعداً لتحديد المواد مع خصائص الأنسولين ميميتيك. وهو يمثل أداة جذابة سد الفجوة الواسعة بين الدراسات في المختبر و في فيفو ويوفر العديد من المزايا مقارنة بالنظم القائمة مثل تكاليف مقبولة، وإجراءات معالجة بسيطة ومعدلات الإنتاجية الكافية. وباﻹضافة إلى ذلك، إذن من لجنة أخلاقية غير مطلوب.
والرزن HET-كام نظام اختبار بديلة مستخدمة على نطاق واسع للتجارب الحيوانية في الصناعة12. ويمثل النظام في ovo الموصوفة هنا نسخة معدلة من الإنزيم HET-كام. بينما في شكلها الأصلي، يتم إجراء تجارب كام HET لدراسة خصائص مزعجة للمركبات وصياغة أو تحليل الأوعية14،،من1516، وعلينا تكييف النهج لاختبار المركبات ذات الخصائص المفترضة الأنسولين ميميتيك12. تجارب غير فقست أجنة الطيور خلال الثلثين الأول من التنمية الجنينية وفقا للتوجيه رقم 2010/63/الاتحاد الأوروبي، لا تحتاج الإذن من قبل لجنة أخلاقية حيث لا تعتبر هذه التجارب تجارب على الحيوانات. وقد أثبتت الدراسات الحديثة مدى ملاءمة النظام في ovo توصيف نجاعة الأعشاب مقتطفات مختارة، التي تم تحديدها في شاشة أساسية المستندة إلى إزفاء GLUT410، للحد من مستويات الجلوكوز في الدم في نظراً لغياب الأنسولين12،13. وتشمل النقاط الحرجة لأداء جيد للنظام في ovo : أولاً، مولده موثوق بها إيصال البيض المخصب. الدجاج البنى الكلاسيكي لومان خيار جيد لسلالة. ثانيا، تنفيذ سمية اختبارات استبعاد التأثيرات السمية لاحتياجات مجمع التحقيق يتعين القيام به. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم إعداد وعاء الدم مناسب لجمع الدم. من المهم لتجنب قطع السفن الكبيرة في غشاء تشوريوالانتويك نفسها، وهذا يمكن أن يؤدي إلى فقدان الدم غير أفضل. وعلاوة على ذلك، قبل أن يتم قطع السفينة إلى قطاع غزة درجة الحموضة، يجب أن تكون يربت الجافة باستخدام ورق الترشيح لمنع تمييع الدم التي تم جمعها. وأخيراً، يبدو عددا كافياً من التجارب الهامة. نوصي باستخدام البيض 10 على الأقل لكل نقطة من الوقت، وتكرار التجربة كل منها ثلاثة إضعاف.
وبطبيعة الحال، هناك بعض القيود المفروضة على هذا النهج في ovo . حيث يستغرق مدة تصل إلى 30 دقيقة حتى يتم استيعابها عبر غشاء كثافة قشرة المواد التي تأتي في اتصال وثيق مع الغشاء تشوريوالانتويك، من غير الممكن التحديد الكمي لاستجابة سريعة للجنين إلى مجمع التطبيقية. وعلاوة على ذلك، قد تكون بعض المركبات السامة في تركيز التطبيقية، الذي كثيرا ما يتسبب في آفات الأوعية الدموية في غشاء تشوريوالانتويك. وهكذا، سيتوتوكسيسيتي الاختبار استناداً إلى حضانة طويلة الأجل من المركبات لمدة حوالي 24 ساعة يبدو معقولاً. وأخيراً، وجدنا أن النظام المخزن المؤقت المستخدم لتطبيق المركبات أثر كبير على أداء المقايسة. 12 حاليا، هبس المخزن المؤقت يستخدم نظراً لأنه يؤدي إلى تأثير أصغر على مستويات السكر في الدم للجنين.
للتطبيقات المستقبلية، قد يكون اختبار نظم المخزن المؤقت الإضافي كبديل لحبس. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تأثير مستخلصات الأعشاب على معلمات إضافية الدم مثل الكوليسترول والشحوم الثلاثية أو البروتينات الدهنية مسألة جذابة.
نظامنا في ovo الجديد أداة هامة وواعدة لاختبار المواد ذات الخصائص الأنسولين ميميتيك في حي دون الحاجة إلى تجربة الحيوان. ولذلك، أنه يسد الفجوة بين النهجين في المختبر و في فيفو . بالمقارنة مع القائمة في ovo نموذج نظم17 ليس هناك حاجة للحث على مرض السكري بالعلاج بالستريبتوزوتوسين (STZ)، كما يمكننا استخدام الأجنة في يوم 10 أو 11 من الحضانة. وفي هذه المرحلة، لم يبدأ إنتاج الأنسولين، ولكن الأجنة بالفعل الأنسولين الحساسة. بالإضافة إلى ذلك، إذن بإنشاء لجنة أخلاقيات قد تكون مطلوبة إذا الأجنة الذين تتراوح أعمارهم بين 14-17 يوما تكون المستعملة17. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الاستراتيجيات البديلة18، تطبيق مجمع كما هو موضح هنا ضارة وشاقة، زيادة تجريبية عن طريق وضع معدلات أقل.
مجتمعة، هذه في ovo نهج نظام جذابة إذا كان تأثير انخفاض الدم من مادة الأنسولين mimetic يحتاج إلى اختبار في حي.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من وكالة النهوض بالبحوث النمساوية (فج؛ المشروع رقم 850681)، ومبادرة جامعة التطبيقية العلوم العليا النمسا التمويل الأساسي (مشروع جلوكوستار) والمركز “الابتكار التكنولوجي” في مجال الطب (مركز موقوت) أن يتلقى التمويل الأساسية بمقاطعة النمسا العليا.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |