In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un’adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l’identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.
I livelli elevati della glicemia nel diabete mellito di tipo 2 (T2DM), una malattia metabolica complessa e multifattoriale, sono causati da errori della β-cellula e resistenza di insulina. Varie strategie, tra cui l’iniezione di insulina o l’utilizzo di farmaci insulino-sensibilizzanti, sono state perseguite per trattare T2DM o almeno ridurre i sintomi. Inoltre, l’applicazione di composti a base di erbe ha attirato l’attenzione aumentante. Pertanto, è necessario trovare sistemi di test efficiente di identificare e caratterizzare composti insulino-mimetici. Qui abbiamo sviluppato un modello di embrione di pulcino modificate, che consente il test di composti sintetici ed estratti di erbe con proprietà insulino-mimetici. Utilizzando un fluorescenza basati su microscopia schermo primario, che quantifica la traslocazione del trasportatore del glucosio (Glut4) 4 alla membrana plasmatica, siamo stati in grado di identificare i composti, principalmente estratti di erbe, che conducono ad un aumento di glucosio intracellulare concentrazioni nei adipocytes. Tuttavia, l’efficacia di queste sostanze richiede ulteriore verifica in un organismo vivente. Così, abbiamo usato un approccio in-ovo per identificare le proprietà di riduzione del glucosio nel sangue. L’approvazione di un comitato etico non è necessaria poiché l’utilizzo di embrioni di pollo durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non è considerato un esperimento sugli animali. Qui, l’applicazione di questo modello è descritto in dettaglio.
Diabete mellito è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia ed è causato da difetti nella secrezione dell’insulina o insulina azione1. Novanta per cento di tutti i casi di diabete sono categoria diabete mellito di tipo 2 (T2DM), dove gli individui dimostrano l’insulino-resistenza e per lo più insulina carenza2. Parecchi fattori sono conosciuti per aumentare l’incidenza globale di T2DM, compreso i cambiamenti nello stile di vita, specialmente quelle relative alla sovranutrizione, l’invecchiamento e l’inattività fisica. Circa 400 milioni di persone hanno il diabete mellito in tutto il mondo secondo l’International Diabetes Federation (IDF). Questo numero è destinato a raggiungere 600 milioni entro i prossimi 20 anni3.
Complicazioni diabetiche causate da iperglicemia ed insulino-resistenza, quali ipertensione, dislipidemia, intolleranza al glucosio, malattia coronarica e malattia vascolare cerebrale, portano ad una significativamente ridotta aspettativa di vita e qualità4. Gli individui commoventi richiedono abbassamento farmacoterapia; Tuttavia, l’utilizzo di farmaci, come la metformina5 spesso è associato con drammatici effetti collaterali6,7,8. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci antidiabetici che sono sicura, ampiamente disponibile ed economica.
Nutraceuticals, estratti, piante e diversi composti a base di erbe sono state attribuite alla proprietà insulino-mimetici di funzione modulando varie funzioni cellulari. Una caratteristica importante è la stimolazione della traslocazione del trasportatore del glucosio (GLUT4) 4 alla membrana plasmatica da scompartimenti di immagazzinaggio intracellulare, risultante in un maggiore assorbimento del glucosio in muscolo e tessuto adiposo in assenza di insulina, noto come Proprietà insulino-mimetici9. In precedenza, abbiamo implementato un approccio di base di microscopia di fluorescenza per quantificare il processo di traslocazione di GLUT410. Analisi di numerosi estratti vegetali da un Estratto di libreria11 usando questa analisi ha portato alla identificazione di candidati promettenti. Tuttavia, ulteriori prove negli organismi viventi sono necessari. L’approccio descritto in dettaglio in questa carta, un modello di embrione di pulcino modificate, ha dimostrato di essere un modello promettente per l’identificazione di sostanze con proprietà insulino-mimetici. Esso rappresenta uno strumento attraente l’ampio divario fra gli studi in vitro e in vivo di riempimento e offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi esistenti quali costi accettabili, le procedure di movimentazione semplice e adeguata velocità di trasferimento. Inoltre, l’autorizzazione da un comitato etico non è necessaria.
Il dosaggio di HET-CAM è un sistema ampiamente utilizzato test alternativi alla sperimentazione animale nel settore12. Il sistema di in-ovo descritto qui rappresenta una versione modificata del test HET-CAM. Mentre nella sua forma originale, HET-CAM sono esperimenti per studiare le proprietà irritanti di composti e formulazione o l’analisi di angiogenesi14,15,16, abbiamo adattato l’approccio alla prova composti con caratteristiche insulino-mimetici putativo12. Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico poiché questi esperimenti non sono considerati gli esperimenti sugli animali. Recenti studi hanno dimostrato l’idoneità del sistema in-ovo per caratterizzare l’efficacia di estratti di erbe selezionati, che sono state identificate in un schermo primario basate su GLUT4-traslocazione10, per ridurre i livelli della glicemia nella assenza di insulina12,13. Punti critici per una buona prestazione del sistema in-ovo comprendono: primo, un allevatore affidabile consegnare le uova fecondate. Il pollo marrone classico Lohmann è una buona scelta di razza. In secondo luogo, l’attuazione di tossicità test per escludere effetti tossici delle esigenze composti studiati per essere fatto. Inoltre, la preparazione di un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue è importante. È importante evitare il taglio di grandi vasi nella membrana corio-allantoidea stesso, come questo può portare a una perdita non-preferibile di sangue. Inoltre, prima che la nave è tagliata sulla striscia di pH, deve essere picchiettata asciutto utilizzando carta da filtro per evitare la diluizione del sangue raccolto. Infine, un numero sufficiente di esperimenti sembra essere importante. Si consiglia di utilizzare almeno 10 uova per ciascun punto di tempo e una triplice ripetizione dell’esperimento rispettivo.
Naturalmente, ci sono alcune limitazioni di questo approccio in ovo . Dato che ci vogliono fino a 30 minuti fino a quando le sostanze sono assorbite attraverso la membrana del guscio d’uovo ed entrano in stretto contatto con la membrana corio-allantoidea, non è possibile quantificare una risposta rapida dell’embrione al composto applicata. Inoltre, alcuni composti possono essere tossiche in concentrazione applicata, che spesso si traduce in lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea. Così, la citotossicità test basati su incubazione a lungo termine dei composti per circa 24 ore appare ragionevole. Infine, abbiamo trovato che il sistema di buffer utilizzato per l’applicazione dei composti ha un effetto significativo sulle prestazioni del dosaggio. 12 attualmente, HBSS buffer viene utilizzato perché si traduce in più leggero effetto sui livelli di glucosio nel sangue dell’embrione.
Per le applicazioni future, possono essere testati sistemi buffer aggiuntivo come alternativa a HBSS. Inoltre, l’influenza di estratti di erbe su sangue ulteriori parametri come colesterolo, trigliceridi o lipoproteine potrebbe essere una domanda interessante.
Il nostro nuovo sistema di in-ovo è un importante e promettente strumento per testare le sostanze con caratteristiche insulino-mimetici in un organismo vivente senza la necessità di un esperimento sugli animali. Pertanto, colma il divario tra gli approcci in vitro e in vivo . Rispetto alle esistenti in ovo modello sistemi17 non c’è nessun bisogno di indurre il diabete dal trattamento di streptozotocin (STZ), come usiamo gli embrioni al giorno 10 o 11 di incubazione. In questa fase, non ha iniziato la produzione di insulina, ma gli embrioni sono già insulina sensibile. Inoltre, l’autorizzazione da un comitato etico potrebbe essere richiesto se usate17embrioni all’età di 14-17 giorni. Inoltre, rispetto a strategie alternative18, l’applicazione di composto come descritto qui è meno nocivo e laborioso, aumentando i tassi di attraverso-metta sperimentali.
Presi insieme, questo in-ovo approccio è un sistema interessante se un effetto sangue-diminuzione della sostanza insulino-mimetici deve essere testato in un organismo vivente.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dall’agenzia di promozione di ricerca austriaco (FFG; numero di progetto 850681), la University of Applied Sciences superiore Austria base Funding initiative (progetto GlucoSTAR) e il centro per l’innovazione tecnologica in medicina (TIMed Center) che riceve il finanziamento base di provincia dell’Alta Austria.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |