I denne undersøgelse beskriver vi en i-ovo system som et lovende redskab til at teste insulin-mimetiske forbindelser i en levende organisme. De vigtigste fordele omfatter passende overførselshastigheder og acceptable omkostninger, som identifikation af fytokemikalier med insulin-mimetiske egenskaber.
Forhøjet blod glucose niveauer i type 2 diabetes mellitus (T2DM), en kompleks og multifaktoriel metabolisk sygdom, er forårsaget af insulin resistens og β-celle fiasko. Forskellige strategier, herunder injektion af insulin eller brugen af insulin-sensibiliserende stoffer, blev forfulgt for at behandle T2DM eller i det mindste mindske symptomerne. Derudover har anvendelse af naturlægemidler forbindelser tiltrukket stadig større opmærksomhed. Det er således nødvendigt at finde effektive testsystemer til at identificere og karakterisere insulin-mimetiske forbindelser. Her udviklede vi en modificeret kylling embryo model, som gør det muligt for afprøvning af syntetiske forbindelser og urteekstrakter, med insulin-mimetiske egenskaber. Ved hjælp af et Fluorescens mikroskopi-baseret primær skærm, der kvantificerer omplantning af Glucose transporter 4 (Glut4) til plasma membran, var vi i stand til at identificere forbindelser, hovedsagelig urteekstrakter, som fører til en stigning af intracellulære glukose koncentrationer i adipocytter. Effekten af disse stoffer kræver imidlertid yderligere kontrol i en levende organisme. Dermed, vi brugte i ovo tilgang til at identificere deres blod glucose-reducerende egenskaber. Godkendelse af en etisk komité er ikke nødvendig, da anvendelsen af kylling embryoner i løbet af de første to tredjedele af embryonale udvikling ikke betragtes som et animalsk eksperiment. Her, er anvendelsen af denne model beskrevet i detaljer.
Diabetes mellitus er en stofskiftesygdom, der er karakteriseret af hyperglykæmi og er forårsaget af defekter i insulinsekretion eller insulin aktion1. Halvfems procent af alle sukkersyge-tilfælde er kategori type 2 diabetes mellitus (T2DM), hvor individer vise insulinresistens og for det meste insulin-mangel2. Flere faktorer er kendt for at øge den globale forekomsten af T2DM, herunder ændringer i livsstil, især dem med tilknytning til overnutrition, aldring og fysisk inaktivitet. Ca. 400 millioner mennesker har diabetes mellitus verdensomspændende ifølge internationale Diabetes Føderation (IDF). Dette tal forventes at nå op på 600 millioner inden for de næste 20 år3.
Diabetiske komplikationer som følge af hyperglykæmi og insulinresistens, hypertension, dyslipidæmi, glucose intolerance, koronar hjertesygdom og cerebrale Vaskulære sygdomme, føre til en betydeligt reduceret levetid og kvalitet4. Berørte personer kræver glukose-sænkende Farmakoterapi; dog, brug af lægemidler såsom metformin5 er ofte forbundet med dramatiske bivirkninger6,7,8. Derfor, yderligere antidiabetika tilgange, der er sikker, bredt tilgængelig og billig er nødvendige.
Forskellige naturlægemidler forbindelser, ekstrakter, planter og nutraceuticals har været tilskrevet funktion insulin-mimetiske egenskaber af modulerende forskellige cellulære funktioner. Et vigtigt element er stimulation af omplantning af glucose transporter 4 (GLUT4) til plasma membran fra intracellulære opbevaringsrum, hvilket resulterer i en øget optagelse af glukose i muskler og fedtvæv i mangel af insulin, kendt som insulin-mimetiske egenskaber9. Tidligere, vi implementeret et Fluorescens mikroskopi-baseret tilgang til at kvantificere translokation proces af GLUT410. Analyse af talrige planteekstrakter fra en ekstrakt bibliotek11 ved hjælp af denne analyse resulterede i identifikation af lovende kandidater. Yderligere tests i levende organismer er dog påkrævet. Metoden beskrevet i detaljer i dette papir, en modificeret kylling embryo model, har vist sig for at være en lovende model til at identificere stoffer med insulin-mimetiske egenskaber. Det er en attraktiv værkstøj fylde den store kløft mellem in vitro og in vivo studier og giver flere fordele sammenlignet med eksisterende systemer såsom acceptable omkostninger, enkel håndtering procedurer og passende overførselshastigheder. Desuden er tilladelse af en etisk komité ikke påkrævet.
HET-CAM assay er en udbredt alternativ testsystem til dyreforsøg industrien12. I-ovo systemet beskrevet her repræsenterer en modificeret version af HET-CAM assay. I sin oprindelige form, HET-CAM forsøg er udført for at studere de irriterende egenskaber af forbindelser og formulering eller analyse af angiogenese14,15,16, har vi tilpasset tilgang til test forbindelser med formodede insulin-mimetiske egenskaber12. Eksperimenter med ikke-udklækket aviær embryoner i løbet af de første to tredjedele af embryonale udvikling behøver ifølge direktiv 2010/63/EU, ikke tilladelse af en etisk komité, da disse forsøg ikke betragtes som dyreforsøg. Nylige undersøgelser har dokumenteret egnetheden af i-ovo -system til at karakterisere effekten af udvalgte urteekstrakter, som er blevet påvist i en GLUT4-omplantning-baserede primære skærm10, for at reducere blodsukkerniveauet i den manglen på insulin12,13. Kritiske punkter for en god præstation i ovo system omfatter: første, en pålidelig opdrætter levere de befrugtede æg. Lohmann klassisk brun kyllingen er et godt valg af race. For det andet gennemførelsen af toksicitet prøver for at udelukke toksisk virkning af de undersøgte stof skal gøres. Udarbejdelsen af et egnet blodkar for blod samling er derudover vigtigt. Det er vigtigt at undgå skæring af store fartøjer i chorioallantoic membranen selv, da dette kan føre til ikke at foretrække tab af blod. Derudover før fartøjet er skåret på pH strimmel, det har at være klappede tør bruge filtrerpapir for at forhindre udvanding af det indsamlede blod. Endelig, et tilstrækkeligt antal forsøg synes at være vigtig. Vi anbefaler at bruge mindst 10 æg for hvert tidspunkt, og en tredobbelt gentagelse af de respektive eksperiment.
Der er naturligvis nogle begrænsninger af denne i ovo tilgang. Da det tager op til 30 minutter, indtil stofferne optages gennem den æggeskal membran og kommer i tæt kontakt med chorioallantoic membranen, er det ikke muligt at kvantificere en hurtig reaktion af embryonet til det anvendte stof. Derudover kan nogle forbindelser være giftige i den anvendte koncentration, hvilket ofte resulterer i læsioner af blodkar i chorioallantoic membranen. Således forekommer cytotoksicitet test baseret på langsigtede inkubation af forbindelser, for omkring 24 timer rimeligt. Endelig fandt vi at den buffersystem til ansøgning af forbindelser har en betydelig effekt på udførelsen af analysen. 12 i øjeblikket HBSS buffer benyttes fordi det resulterer i den mindste virkning på blod glucose niveauer af embryoet.
For fremtidige ansøgninger prøves yderligere buffersystemer som et alternativ til HBSS. Desuden kan urteekstrakter indflydelse på ekstra blodparametre såsom kolesterol, triglycerider eller lipoprotein være en attraktiv spørgsmål.
Vores nye i-ovo system er en lovende og vigtigt værktøj til at teste stoffer med insulin-mimetiske kendetegn i en levende organisme uden brug af en animalsk eksperiment. Derfor, det udfylder hullet mellem in vitro og in vivo tilgange. I forhold til eksisterende i-ovo model systemer17 er der ingen grund til at inducere diabetes ved streptozotocin (STZ) behandling, som vi bruger embryoner på dag 10 eller 11 inkubation. På dette stadium, insulinproduktion er startet ikke, men embryonerne er allerede insulin følsomme. Derudover kan tilladelse af en etisk komité være påkrævet, hvis embryoner i alderen 14-17 dage er brugt17. Desuden, i forhold til alternative strategier18, sammensatte programmet er som beskrevet her mindre skadelige og besværlig, øge eksperimentelle gennem læg priser.
Tilsammen, dette i ovo er tilgang et attraktivt system, hvis en blod-faldende effekt af et insulin-mimetiske stof skal afprøves i en levende organisme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af den østrigske forskning erhvervsfremme Styrelsen (FFG; projektnummer 850681), University of Applied Sciences øvre Østrig grundlæggende finansiering initiativ (projekt GlucoSTAR) og Center for teknologisk Innovation i medicin (tidsindstillet Center) der modtager grundlæggende finansiering af provinsen Oberösterreich.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |