Ett instrument och metoder för beredning av nliter provvolymer för transmissionselektronmikroskopi presenteras. Inga papper-analys steg krävs, så att man undviker de negativa konsekvenser som detta kan ha för proteiner, avsevärt minska prov förlust och möjliggöra analys av enstaka cell lysate för visuell proteomik.
På grund av senaste tidens tekniska framsteg blir cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) snabbt en standardmetod för den strukturella analysen av proteinkomplex till atomär upplösning. Protein isolering tekniker och prov förberedelse metoder för EM är dock fortfarande en flaskhals. Ett relativt litet antal (100.000 till några miljoner) enskilda protein partiklar måste avbildas för högupplösta analys av proteiner av den enda partikeln EM strategi, att göra miniatyriserade prov hantering av tekniker och mikroflödessystem principer genomförbart.
En miniatyriserade, papper-blotting fri EM rutnät förberedelse metod för provet förkonditioneringen, EM rutnät priming och efterbearbetning som endast förbrukar nliter-volymer av provet presenteras. Metoden använder en dispenseringssystem med sub-nliter precision kontroll flytande upptag och EM rutnät priming, en plattform för att styra rutnät temperaturen därmed bestämma den relativa fuktigheten ovanför rutnätet EM, och en pick-och-steget-mekanism för prov förglasning. För cryo-EM, ett EM rutnät placeras på temperaturkontrollerade scenen och provet är aspirerade i en kapillär. Kapillär spets är placerad i närheten av rutnät ytan, rutnätet är laddad med provet och överskott är åter aspirerade i microcapillary. Därefter är prov filmen stabiliserad och något tunnas genom kontrollerade vattenavdunstning regleras av förskjutningen av plattform temperaturen i förhållande till daggpunkt. Vid en given punkt utlöses plocka-och-steget mekanismen, snabbt överföra primade EM rutnätet till flytande etan för provet förglasning. Alternativt finns prov-conditioning metoder att förbereda nliter provvolymer för negativa fläcken (NS) EM.
Metoderna som minskar prov konsumtion och undvika strategier som är potentiellt skadliga proteiner, såsom den filterpapper blotting används i konventionella metoder. Dessutom tillåter den minimala mängden prov krävs nya experimentella strategier, såsom snabb prov luftkonditionering, kombination med enskild cell lysis för ”visual proteomik”, eller ”lossless” totala provberedning för kvantitativ analys av komplexa prover.
Maskinvara och programvara för den strukturella analysen av proteinkomplex av transmissionselektronmikroskopi (TEM) har massivt avancerade under senare år. De förbättringar som gjorts banade väg för en ”resolution revolution”1,2 och strukturella forskning i grunden förändrat. Revolutionen började med tillkomsten av cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM)3,4, så att utarbetandet av biologiska prover under nära fysiologiska förhållanden samtidigt minska strålning känslighet och förhindra provavdunstning i hög vakuum av överföring elektronmikroskop5. Under de följande åren ökat inkrementell tekniska framsteg successivt upplösningen kan uppnås. Bland dessa innovationer var tillämpningen av fältet-utsläpp guns6,7, och, mer nyligen, förbättrat data analys algoritmer, till exempel högsta sannolikheten metoder8,9. Direkt elektron detektor kameror10,11,12,13, filmläget imaging och medföljande programvara utvecklingen14,15, 16 , 17, förutsatt det slutliga genombrottet som krävs för att uppnå atomär upplösning för biologiska prover av enda Partikelanalys (för en granskning se Cheng, Grigorieff, o.a. 18). vikten av cryo-EM har nyligen erkänts av tilldelning av Nobelpriset i kemi till tre pionjärer.
För att bild ett biologiskt prov av TEM, den metod som används för att ladda EM rutnätet med prov (senare kallad ”grid förberedelse”) måste säkerställa att den resulterande prov lagret (i) är tunt nog (< 100 nm) att undvika omfattande buller av oelastisk eller multiplicera utspridda elektroner, (ii) tål hög vakuum av elektronmikroskopet, och (iii) skyddar biomolekyler från strålskador. Två huvudsakliga metoder används för att uppfylla dessa Semesterpengar: negativa fläcken(NS)19,20 förfaranden (figur 1A) adsorberas provet till en tunn kolfilm, bädda in biomolekyler i amorf tungmetall och sedan Låt enheten torka i luften. Detta är enkel och snabb, och laddade EM rutnäten (senare kallad ”prov grids”) är lätta att lagra och kan förvaras under längre tid (vanligtvis år). I TEM, förberedelserna uppvisar hög kontrast på grund av NS och tolerera högre elektron doser än cryo-preparat, men upplösningen är begränsad till ca 20 Å. Cryo-EM förfaranden (figur 1B) anställa holey kol stöder. En tunn film av provlösningen är sträckte över hålen och rutnätet EM är försatt i en cryogen, oftast flytande etan, att snabbt kyla det under-150 ° C. Resultatet är en amorf, förglasad, 50 till 100 nm tjock film av lösningen i stöd hålen. Denna tunna, amorft film tål hög vakuum i elektronmikroskopet och, i det ideala fallet, bevarar biologiska strukturer i sitt ursprungliga tillstånd. Förfarandet gör det möjligt för biologiska prover som avbildas på högupplösta. Dock förvaras rutnätet provet vid temperaturer under-150 ° C vid alla tidpunkter att undvika devitrification. Det kan avbildas med relativt hög elektron doser på grund av den låga temperaturen, men kontrasten och signal-brus-förhållande är ändå låg. Därför, genomsnitt tekniker utnyttjas för att öka kontrasten och förutsatt att provet är avbildad från olika vinklar, kartan högupplösta tredimensionella (3D) kan rekonstrueras. Vanligaste de och mycket framgångsrika metod för 3D rekonstruktion från och med nu är det enda partikel tillvägagångssättet. För en senare genomgång, se Cheng al.18.
Negativa fläcken TEM (NS-EM) är viktigt för screening och kvalitetskontroll, när hög kontrast behövs eller när det finns endast begränsade mängder prov (adsorption till carbon film generellt koncentrerar provet). Enda partikel cryo-EM är den guld-standard metoden om högupplösta 3D rekonstruktioner av proteinstruktur är avsedd för.
Figur 1: principer av TEM rutnät förberedelse och jämförelse mellan klassiskt (panelen A, B) och en mikroflödessystem strategi (panel C, D). A) klassiskt NS-EM rutnät förberedelse: om 3 µL prov är pipetteras för hand på ett EM rutnät täckt med en kontinuerlig carbon film (senare benämnd som ett ‘NS-EM rutnät’) (i). Efter inkubation för ca 10 s, filterpapper används för att torka bort överflödig vätska från sida (ii), lämnar den adsorberade biomolekyler i en tunn vattenfilm. Därefter proteinet inkuberas i en tungmetall salt lösning, t.ex., 2% uranyl acetat, för 20 s (iii), och igen vätskan avlägsnas genom att läska från sidan med filterpapper (iv). Slutligen, EM-rutnätet är kvar för att torka i luften. B) klassiskt cryo-EM rutnät förberedelse: om 3 µL prov är pipetteras en hand på en holey carbon film. För att bilda en tunn prov film, avlägsnas överskott vätska genom papper-blotting ansikte-on från ena eller båda sidorna (ii). Rutnätet är slutligen snabbt störtade ner i flytande etan för förglasning (iii). C) NS-EM rutnät förberedelse med cryoWriter setup: A 5 nL volym är aspirerade från provet lager med hjälp av en microcapillary (i). För prov konditionering, är microcapillary spets nedsänkt i luftkonditionering lösning, t.ex., 2% ammoniumacetat. Joner och små molekyler utbyts genom diffusion (ii). Observera att måtten på microcapillary se till att hela processen är diffusion drivs. Proteiner har mycket lägre diffusion konstanter än salt joner och är inte betydligt förlorat24. Slutligen är provet expedieras på rutnätet och tillåtas torka (iii). D) principer av cryo-EM rutnät preparatet med hjälp av cryoWriter-baserade metoden: An EM rutnät täckta av ett holey kol placeras på ytan av en temperatur-kontrollerad plattform och innehas av pincett. Temperaturen i plattformen styrs på en förskjutning från dagg pekar temperatur rutnät miljön. Rutnätet flyttas i förhållande till den microcapillary som innehåller provet och microcapillary sänks tills det är några mikrometer ovanför rutnätet. Därefter är några Polykarbonatet av provet förpackat från det medan scenen flyttas i ett spiralmönster; överflödig vätska är åter aspirerade (i). Efter EM rutnät grundning, microcapillary dras och rutnätet förblir på temperatur kontrollerade plattformen (senare kallad daggpunkt (DP) scenen) för kort tid för att tillåta en kontrollerad mängd prov att avdunsta. För steget frysning, är rutnätet snabbt dras tillbaka från scenen med pincetten (ii), vänt 90 ° i vertikal position och störtade ner i ett cryogen bad (iii) (senare benämnd ‘pick-och-steget’ mekanismen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tyvärr har inte de rutnät förberedelse metoder för NS och cryo-EM förbättrats avsevärt sedan de uppfanns. Nuvarande nackdelar är den höga samplingsfrekvenser förbrukningen (ca 3 µL av 1 mg/mL protein) och den stora mängden (> 99%) av provet förlorade (figur 1A, B). Den klassiska metoden som används för att förbereda rutnät för cryo-EM är dessutom en hård procedur för proteiner: först, det innebär en omfattande ansikts-på papper-analys steg (figur 1B, ii), och, andra, proteinet är utsatt för gränssnittet luft-vatten för en betydande mängd tid21. Här, en alternativ metod för prov förkonditionering, grid provberedning och efterbehandling (grid torkning eller förglasning) för NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (figur 1D) presenteras. Inställningen för det interna byggda, kallas ”cryoWriter”, använder miniatyriserade prov hantering teknik och mikroflödessystem principer att aspirera, skick och dispensera provet, undvika papper blotting helt och att tillhandahålla alternativa metoder till tunna prover för Cryo-EM. Det avsevärt minskar prov konsumtion och förbättrar användaren-kontroll över provberedning som helhet. Dessutom tillåter metoden nya experimentella tillämpningar; till exempel utarbetande av isolerade biologiska komponenter av enskilda celler i en strategi som kallas ”enda cell visuella proteomik”22,23,24,25.
‘CryoWriter’ instrumentet och de protokoll som krävs för att förbereda prov rutnät för NS – och cryo-EM från nL storlek totala provvolymer och helt undvika det klassiska papper-blotting steget presenteras. Mikroflödessystem principer och en mikromekaniska system kombineras i cryoWriter att göra detta möjligt.
Vår erfarenhet visar att när de miniatyriserade metoder som presenteras i detta manuskript används parametern utrymmet för EM-grid förberedelse är större än för klassiska metoder och under hårdare användarkontroll. Viktigast av allt, gör ökad reproducerbarhet uppnås det möjligt att förhandsgranska med prov buffertsystem, kompletteras med en lättillgänglig test protein, att avgöra de optimala parametrarna innan själva experimentet utförs. Detta håller förbrukningen av provet av intresse till absolut minsta och rekommenderas starkt. Kritiska steg för båda NS – och cryo-EM rutnät beredning är: (i) Priming av pumpsystemet. för sub-nliter volym dispensering, måste systemet vätska (vatten) avgasade och bubble gratis. (ii) exakt kontroll av glöd eller plasma rengöring steg; rutnätet EM ytan egenskaper är avgörande för reproducerbara resultat. (iii) prov luftkonditionering; den tid som krävs för luftkonditionering, t.ex., med NS, beror på bufferttyp, salthalt och koncentration (figur 3), samt på munstycket geometri av den microcapillary24. (iv) avdunstningen för NS-EM förberedelser för kvantitativa EM; kaffe-ring effekten kan förbjuda kvantitativ analys av NS-EM förberedelser och måste undertryckas av långsam avdunstningen som kontrolleras av DP-scenen.
Olika aspekter av presenterade rutnät förberedelse metoder kan kombineras fritt möjliggör utveckling av mångsidiga protokoll för specifika prover. Typiska exempel skulle vara borttagning av en substans som hindrar högupplösta EM, t.ex., glycerol, av en luftkonditionering steg före rutnät förberedelse för cryo-EM; införandet av medlare molekyler, såsom ligander, av konditionering innan gallren är beredda; eller undersökning av enstaka cell lysate av NS – eller cryo-EM (figur 6).
Användning av mikrofluidik och minimal prov beloppen i de presenterade metoderna tar helt bort behovet av papper-analys steg. Detta är en stor fördel, eftersom papper blotting är en hård behandling för proteiner, potentiellt kontaminerande provet med oönskade joner och sin natur leder till massiv prov förlust. Effekter som eventuellt orsakas av luft-vatten gränssnittet för den tunna prov film bildas när cryo-EM prover är beredda på klassiskt sätt undviks däremot, inte när cryoWriter används. Galler passar cryo-EM kan förberedas med en mindre än 0.2 s väntetiden mellan exempelprogrammet och förglasning (inga data anges). Men när proteiner reser några tiondelar av en nanometer i några nanosekunder genom diffusion, finns det fortfarande tillräckligt med tid för dem att kollidera med luft-vatten gränssnittet för en 100 nm tjockt prov film flera gånger. Men mängden proteiner klibbar till luft-vatten-gränssnittet kan minskas betydligt genom dessa kort tid luckor och kan hindra protein denaturering eller begränsas partikel orientering. En annan lovande metod som kan skydda känsliga proteiner från luft-vatten-gränssnittet är att täcka prov filmen av lågmolekylära ytaktiva ämnen. Dessa föreningar kan införas snabbt av en luftkonditionering steg i cryoWriter innan grid förberedelse. Hög yta till volym förhållandet mellan mikroflödessystem system är en ytterligare begränsning av cryoWriter, som prov kan potentiellt förloras genom ospecifikt adsorption till microcapillary ytan och störa kvantitativ analys av partikelräkning. Problemet behandlas i två sätt: för det första provet inte resa långa sträckor inom microcapillary. Faktiskt förblir nliter provvolymen vid kapillär spets under hela behandlingen. Andra ytan att volymförhållandet reduceras ytterligare genom att använda microcapillaries med relativt stora inre diametrar, t.ex., 180 µm. tredje, ytbehandlar av microcapillaries kan vara enkelt passiviseras vid behov, t.ex., genom att behandla dem med kommersiellt tillgängliga polylysine etanol glykoler (PLL-PEG).
Den högupplösta analysen av proteiner av den enda partikel-metod som används i EM kräver endast 100.000 till några miljoner bilder av enskilda protein partiklar. Detta innebär att mikroflödessystem tekniker kan ge tillräckligt proteinkomplex för strukturella undersökningen. En miniatyriserade immuno-nederbörd metod för snabb isolering av proteinkomplex (cirka 1 timme) från minimal cell belopp (ca 40.000 celler) utvecklades tidigare28. Denna metod kommer nu kopplas direkt till förberedelsestadiet miniatyriserade prov av cryoWriter. Det slutliga målet är att utveckla en integrerad mikroflödessystem pipeline för ultrasnabb protein isolering och cryo-EM rutnät beredning som kräver mindre än två timmar sammanlagt. Dessutom framgår av figur 6, minuten mängden och mängden material som behövs för provberedning och nästan lossless luftkonditionering och rutnät arbetsgången uppnås med hjälp av cryoWriter, gör det möjligt att studera proteinet komplex av enskilda celler. Tillsammans, lägga metoden miniatyriserade immuno-nederbörd och cryoWriter grunden för en ny proteomik metod som kallas ”enda cell visuella proteomics”, som vi nyligen visat för heat-shock experiment24. Data analys algoritmer inriktad på analys av ”visuella proteomik” bilder är för närvarande testas.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka seminariet av Basels av universitetar Basel för deras stöd, S. A. Müller för kritiska diskussioner och noggrant läsa manuskriptet, A. Fecteau-LeFebvre för tekniskt bistånd med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann för membranprotein testa prover (alla från C-CINA, Basels, universitetar av Basel) och A. Engel, emeritus universitet Basel för sitt inspirerande samtal. Proverna var vänligen tillhandahållen av s. Ringler, M.-A. Mahi, och T. Schwede (Basels, universitetar av Basel), P. Leiman (laboratoriet för strukturbiologi och biofysik, EPFL) och R. Diaz-Avalos (New York strukturell biologi Center, USA). Projektet stöddes av schweiziska nanovetenskap Institute (SNI, projektet P1401, ARGOVIA projekt MiPIS) och schweiziska National Science Foundation (SNF, projektet 200021_162521).
Liquid handling | |||
Microcapillary tip | New Objective | FS360-100-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20 |
FS360-150-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20 | ||
Conductive sleeve | New Objective | CONGAS-1 | Conductive Elastomer for HV contact, 12" long |
Fused silica tubing | BGB-Analytik | TSP-150375 | TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter |
PressFit Connector | BGB-Analytik | 2525LD | Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 |
Syringe 10 µl | BGB-Analytik | HA-80001 | Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included) |
Syringe pump controller | Cetoni | A3921000093 | neMESYS controller |
Syringe pump dosing unit | Cetoni | A3921000095 | neMESYS dosing unit |
Temperature control | |||
Dew point sensor | Meltec | UFT75-AT | Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL |
Temperature sensor | Sensorshop24.ch | LS7-PT1000-1.0-3L | Surface mountable temperature sensor Pt1000 |
Peltier controller | Cooltronic | TC2812 | PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output |
Peltier element | Distrelec.ch | PE-127-14-15-S | 40×40 mm |
Water-cooling block | – | – | Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base |
Water pump | Digitec.ch | 294877 | XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4 |
Water heat exchanger block | – | – | Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water |
Small water coolers | PCHC.ch | 223050 | Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs |
Small peltier elements | Distrelec.ch | PE-031-10-15-S | Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs |
Mechanics | |||
Linear stage z-axis | Dyneos AG | M-404.2PD | High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor |
Stage controller | Dyneos AG | C-863 | Mercury Servo Controller |
Microscope xy-axis stage | Prior Scientific | H117EIL5 | Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope |
Small permanent magnets | Supermagnete | S-05-08-N | Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10 |
Small electromagnet | Schramme | EG1025A02/110 | Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W |
Controller electromagnet | Conrad.ch | MST-1630.001 7 | Electromagnet control PCB board |
Solenoid hub | Distrelec.ch | HD8286-R-F-24V100% | Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W |
Mini tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0302-M5S-PS | Dumont Type 5 mini, super thin tips |
Various optomechanical parts | Thorlabs | – | – |
Various mechanical parts | Workshop Biozentrum, University Basel | – | Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files |
Optics | |||
Laser diode | Thorlabs | CPS780S | 780 nm laser diode module 2.5 mW |
Photo detector | Thorlabs | PDA100A-EC | Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2 |
EM grids | |||
DURASIN FILM TEM | emsdiasum.com | DTF-03523 | 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5 |
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Buffers / Neg. stain | |||
PBS | Sigma | D8537 SIGMA | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline |
NanoVan 2% | nanoprobes.com | Negative stain vanadium based | |
NanoW 2% | nanoprobes.com | Negative stain tungsten based | |
Software | |||
openBEB | The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable | ||
CryoWriter control software (openBEB plugin) | Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply. |