CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer
Summary
Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.
Abstract
Fehlbildung des Gehirns wird oft durch genetische Mutationen verursacht. Entschlüsselung der Mutationen bei Patienten gewonnenem Gewebe hat mögliche ursächliche Faktoren der Krankheiten identifiziert. Um den Beitrag der eine Dysfunktion der mutierten Gene zur Krankheitsentwicklung zu validieren, ist die Generation von Tiermodellen, die Mutationen tragen ein offensichtlicher Ansatz. Während Keimbahn gentechnisch Mausmodellen (GEMMs) sind beliebte biologische Hilfsmittel und reproduzierbare Ergebnisse aufweisen, ist beschränkt durch die Zeit und Kosten. Unterdessen können nicht Keimbahn GEMMs oft erkunden Genfunktion in praktikabler Weise. Da einige Gehirn Krankheiten (z.B. Hirntumoren) scheinen aus somatischen ergeben aber nicht Keimbahn-Mutationen, nicht Keimbahn chimärer Maus-Modellen, in der normale und abnormale Zellen nebeneinander bestehen, für die krankheitsrelevanten Analyse hilfreich sein könnte. In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Einarbeitung von CRISPR-vermittelte somatische Mutationen im Kleinhirn. Speziell, wir nutzten bedingte Knock-in Mäusen, in denen Cas9 und GFP chronisch durch die CAG (CMV Enhancer/Huhn ß-Actin) Projektträger nach Cre aktiviert sind-vermittelten Rekombination des Genoms. Selbst entworfene Single-Guide RNAs (SgRNAs) und die Cre-Rekombinase-Sequenz, beide in einer einzigen Plasmid-Konstruktion, kodiert wurden in zerebelläre Stamm/Vorläuferzellen im Anfangsstadium mit in Utero Elektroporation geliefert. Infolgedessen wurden transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP), und erleichtert so die phänotypische Analysen beschriftet. Daher ist diese Methode nicht nur Elektroporation-basierte gen Lieferung in zerebelläre Embryonalzellen zeigen aber auch vorschlagen einen neuartigen quantitativen Ansatz um CRISPR-vermittelten Verlustfunktion-Phänotypen zu beurteilen.
Introduction
Erkrankungen des Gehirns sind eines der schrecklichsten tödlichen Krankheiten. Sie resultieren oft aus genetischen Mutationen und anschließende Dysregulation. Zum Verständnis der molekularer Mechanismen von Erkrankungen des Gehirns haben immer anhaltende Anstrengungen zu entschlüsseln, die Genome von menschlichen Patienten eine Reihe von möglichen begründenden Genen entdeckt. Bisher wurden Keimbahn gentechnisch Tiermodellen in Vivo Gain-of-Function (GOF) und Verlustfunktion (LOF) Analysen von solchen Kandidatengenen genutzt. Durch die beschleunigte Entwicklung von funktionalen Validierungsstudien ist eine praktikable und flexible in Vivo gen Testsystem für das Studium der Genfunktion wünschenswert.
Die Anwendung einer in Vivo -Elektroporation-basierte gen-Transfer-System, das sich entwickelnde mausgehirn ist für diesen Zweck geeignet. In der Tat haben mehrere Studien in Utero Elektroporation mit ihr Potenzial durchzuführen Funktionsanalysen in die entwickelnde Gehirn1,2,3gezeigt. Tatsächlich haben mehrere Regionen des Gehirns Maus, z. B. die Großhirnrinde4Retina5, Zwischenhirn6, Hinterhirn7, Kleinhirn8und Rückenmark9 durch somatische Gentherapie Lieferung ins Visier genommen Ansätze, so weit.
In der Tat hat transiente Genexpression von in Vivo Elektroporation auf embryonale mäusegehirnen lange für GOF-Analyse verwendet. Den letzten Transposon-basierte genomische Integrationstechnologien weiter aktiviert langfristige und/oder bedingte Expression von Genen Interesse10,11, was vorteilhaft in einer räumlichen und zeitlichen Weise während der Genfunktion sezieren ist Entwicklung. Im Gegensatz zu GOF Analyse wurde LOF Analyse schwieriger. Während die Transiente Transfektion von SiRNAs und ShRNA-tragenden Plasmide durchgeführt wurde, sind Langzeitwirkungen von LOF Gene nicht wegen eventuellen Abbau von exogen eingeführten Nukleinsäuren wie Plasmide und DsRNAs garantiert. Die CRISPR/Cas-Technologie bietet jedoch einen Durchbruch im LOF Analysen. Genen Codierung fluoreszierende Proteine (z. B.GFP) oder biolumineszenter Proteine (z.B.Firefly Luciferase) haben gemeinsam mit CRISPR-Cas9 und SgRNAs der Zellen, CRISPR-Cas9-vermittelte somatische Mutationen zu kennzeichnen transfiziert wurden. Trotzdem, dieser Ansatz hätte Einschränkungen in funktionelle Studien auf Proliferierende Zellen da exogene Markergene verdünnt und nach langfristigen Verbreitung abgebaut. Während die transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen CRISPR-induzierte Mutationen in ihrem Genom unterziehen, können ihre Spuren im Laufe der Zeit verloren gehen. Genetische Kennzeichnung Ansätze wäre daher geeignet, um dieses Problem zu umgehen.
Vor kurzem haben wir eine LOF CRISPR-basierte Methode in zerebelläre Granulat-Zellen, die eine langfristige Verbreitung während ihrer Differenzierung12durchlaufen entwickelt. Um den transfizierten Zellen genetisch zu beschriften, wir ein Plasmid trägt eine SgRNA zusammen mit Cre gebaut und Cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Mäuse13 in Utero Elektroporation mit das Plasmid eingeführt. Im Gegensatz zu normalen Plasmid-Vektoren Codierung EGFP, dieser Ansatz erfolgreich mit der Bezeichnung transfizierten Granulat Neuron Vorstufen (festzulegenden) und ihre Tochterzellen. Diese Methode bietet großen Unterstützung in Vivo -Funktion von Genen des Interesses an proliferierenden Zellen im normalen Gehirnentwicklung und einem Tumor neigende Hintergrund zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit Exo Utero Elektroporation, haben wir bereits berichtet, dass SiRNA basierenden in Vivo Funktionsanalysen des Atoh1 in einem frühen Stadium der zerebelläre Granulat Zell-Differenzierung8. Durch SiRNA Verdünnung/Abbau und Exposition von Embryonen außerhalb der Gebärmutterwand beschränkte sich die phänotypische Analyse der elektroporiert Granulat Zellen auf embryonalen Phase. Jedoch aktiviert die aktuelle Methode Analyse des Phänotyps der postnatalen Tiere.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim und Petra Schroeter für technische Hilfe. Wir danken auch DRS. K. Reifenberg, K. Dell und P. Prückl für hilfreiche Unterstützung für Tierversuche am DKFZ; die Imaging Core Facilities des DKFZ und Carl Zeiss Imaging Center im DKFZ für die Bildgebung der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (DK) unterstützt.
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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