젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 불행히도, 게놈 생성 또는 transcriptomic 라이브러리에 대 한 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 그리고 연구원은 특정 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 젤-seq 연구원은 DNA와 RNA 100-1000 셀 하이드로 겔 간단한 장치를 사용 하 여 시작에 대 한 라이브러리를 동시에 준비 하 여이 문제를 해결 합니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 우리 설계 젤-seq; 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있도록 많은 유전학 실험실 이미 젤-seq 장치 제작을 재현 하는 필요한 장비. 우리의 프로토콜 사용 하 여 두 전체 사본 증폭 (WTA)에 대 한 키트 일반적으로 사용 되 고 라이브러리 준비는 연구원에 게 이미 익숙할 것 또한 라이브러리 생성 하 게놈 그리고 transcriptomic에 정통한. 우리의 접근 연구원을 무시할 수 추가 비용와 분할 하지 않고 단일 샘플에 DNA와 RNA 시퀀싱의 힘을가지고 있습니다.
서론
차세대 시퀀싱 (NGS) 유전학 연구는 실시 방법에 깊은 영향을 했다. 연구원은 한 번 전체 종의 게놈 시퀀싱에 초점을 맞춘, 단일 종양 또는 심지어 한 실험에 있는 단일 셀의 게놈을 시퀀싱 수 지금이. 1 NGS는 또한 했다 비용 효율적인 셀 데이터는 transcriptome로 알려진 컬렉션 내 RNA 사본 시퀀싱 하. 능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 2 , 3 , 4 는 불행 하 게도, 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 하 고 연구원은 주어진된 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 시작 샘플 충분히 큰 경우 반으로 나눌 수 있습니다. 그러나 작은 스케일에서, 샘플 분할로 인해 재료의 손실 라이브러리 품질에 영향을 하 고 셀 사이의 재미 있는 변화 밖으로 평균 수 샘플 풀링. 5 또한, 연구팀은 단일 세포 또는 작은 다른 유형의 종양 생 검 등 분할 수 없는 샘플 검사에 점점 관심이 있습니다. 6
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 화학 솔루션 준비
참고: 다음 단계는 이후 단계에서 필요한 화학 솔루션을 준비. 이러한 대량에서 만든 고 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다.
- 시작 하려면, 어떤 오염 DNA 중화 15 분 (15 mJ/cm2 총 노출) 254 nm 자외선 가교 오븐에 살 균 하 여 정화, 이온 물 50 mL를 준비 합니다. 다음 단계에 사용 하기 위해 37 ° C에가 열.
- 총 40% (T) 및 3.3 %crosslinker (C) (29: 1) 10 mL를 만들기 polyacrylamide 전조가 솔루션. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.133 g 3.867 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 최대 10 mL 따뜻한 물 정화와 소용돌이 녹아 때까지. 스토어 실 온에서 빛 으로부터 보호입니다.
참고: Premixed 40 %T, 3.3 %C (29: 1) polyacrylamide 솔루션 구입하실 수 있습니다 상업적으로. - 50 %T, 5 %C 젤 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. 아크릴 모노 머의와 비스 아크릴 아 미드 단위체의 0.250 g 4.750 g 무게. 결합 하 고 볼륨을가지고 따뜻한 물 정화 및 해산 때까지 소용돌이 사용 하 여 최대 10 mL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
젤-seq 장치에서 gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 물리적 분리 형광 젤 영상; 통해 구상 될 수 있다 대표 결과 그림 3에 표시 됩니다. 패널 A 표시 조작된 젤-seq 장치; 거짓 색상 구별 다른 젤 지역에 추가 되었습니다. B 패널의 유효성 검사에 사용 하는 4 개의 다른 분판을 가까이 나타난다. 3 레인, 부정적인 컨트롤 배경 나타내고 인터페이스에서 젤의 아무 autoflourescence는 보여줍니다. 우리는 DNA 사다리와 함께 첫 번째 및 두 번째 차선을 로드. 이 차선 표시 낮은 및 고밀도 세포 막, 작은 조각 저밀도 젤을 통해 전달할 수 있습니다 공개 간의 인터페이스에만 어두운 밴드. 4 레인의 생물 학적 샘플의 동작을 보여 줍니다: 500 PC3 셀. 우리는 프로토콜의 3 단계에서 설명한 대로 레인 4 로드. 이미지는 genomic DNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 분리를 보여줍니다. .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
젤-seq 장치 제조 뿐만 아니라 프로토콜 자체와 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제조, 중 젤의 다양 한 지역에 대 한 소정의 레이어 두께 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 우리는 다른 제조 옵션을 테스트 하는 중요 한 시간을 보냈다 고 여기에 설명 된 프로토콜 카세트에 테이블의 재료 및 시 약에대 한 가장 좋은 장치를 생성 합니다. 연구자는 다른 카세트 시스템을 사용 하는 경우 그들은 장치를 만들 때 사용 하는 볼륨을 조정 하는 데 필요한 찾을 수 있습니다. 제조의 주요 과제는 고밀도 젤 영역이 카세트의 가장자리에서 delaminate 하 고 전기 중단 됩니다 카세트의 내부에 공기 주머니를 만들 수 너무 큰 경우. 여러 다른 레이어 볼륨 여러 카세트를 캐스팅 하 여 연구원 신속 하 게 그들의 특정 하드웨어에 대 한 최적의 구성을 확인할 수 있어야 합니다.
젤-seq 프로토콜 또한 프로토콜 완료 되기 전에 유효성을 검사할 수 있는 몇 가.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
KZ는 공동 설립자 및 Singlera 유전체학 inc의 과학 고문
감사의 글
이 작품에 대 한 자금 제공에 의해 대학의 샌디에고, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램, NIH R01-HG007836, 부여 하 고 한국 정부 과학, 정보 통신 및 미래 계획에 의해 했다.
여러 인물의 이전 버전 "Hoople, G. D. 외 에 처음 출판 되었다 젤-seq: 전체 게놈 그리고 transcriptome 시퀀싱 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 반 투과성 히드로 장벽을 사용 하 여. 실험실에 칩 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " 칩에 실험실이이 발행물에서 그림의 재사용을 허가 했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 아크릴아미드 단량체 | 시그마 Aldrich | A8887-100G | |
| 과황산암모늄 | 시그마 Aldrich | A3678-25G | |
| Ampure XP 비즈 | Beckman Coulter | A63880 | 텍스트에서 고체상 가역성 고정화(SPRI) 비드로 언급됨 |
| DNA 겔 로딩 염료(6x) | ThermoFisher Scientific | R0611 | 본문에서 6X 로딩 염료 |
| 에틸 알코올 | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| KAPA SYBR FAST 원스텝 qRT-PCR 키트 | Kapa BioSystems | 7959613001 | 본문에서 2X qPCR mix |
| N,N′-Methylenebis(아크릴아미드)로 언급됨 | Sigma Aldrich | 146072-100G | 비스-아크릴아미드 |
| NexteraXT DNA Library Preparation Kit (본문에서는 library preparation kit라고 함) | Illumina | FC-131-1024 | 포함: TD (본문에서는 transposase buffer라고 함), ATM (본문에서는 transposase로 언급), NT (본문에서는 transposase stop buffer라고 함) 및 NPM (본문에서는 library prep PCR mix라고 함) |
| Nuclease Free Water | Millipore | 3098 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| SMART-Seq v4 Kit (본문에서는 전체 전사체 증폭(WTA) 키트라고 함) | Takara/Clontech | 634888 | 포함: 용해 완충액, RNase 억제제, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (본문에서는 RT 프라이머), 5X Ultra Low First Strand Buffer (본문에서는 1차 가닥 완충액이라고 함), SMART-Seq v4 Oligonucleotide(본문에서는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)라고 함), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (본문에서는 역전사 효소라고 함) 및 PCR Primer II A (본문에서는 cDNA PCR 프라이머라고 함) |
| WTA 어댑터가 있는 무작위 헥사머 | IDT | n/a | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′ |
| 설탕 | 시그마 알드리치 | S0389-500G | |
| TEMED | 시그마 알드리치 | T9281-25ML | |
| DNA 어웨이 표면 오염 제거 | ThermoFisher Scientific | 7010PK | 본문에서는 DNA 제거 제품이라고 합니다 |
| Tris-Borate-EDTA 완충액 (10X 농도) | Sigma Aldrich | T4415-1L | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO에 10,000X 농축액) | ThermoFisher Scientific | S11494 | 텍스트에서는 gel stain |
| Equipment | |||
| BD Precisionglide로 언급됨; 주사기 바늘, 게이지 18 | Sigma Aldrich | Z192554 | 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다 |
| Branson CPX 시리즈 초음파 욕조 | Sigma Aldrich | Z769363 | 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다 |
| 빈 젤 카세트, 미니, 1.0mm | ThermoFisher Scientific | NC2010 | 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다 |
| .메쉬 필터 플레이트 - Corning HTS Transwell 96 유정 투과성 지지체 - 8.0 &마이크로; m pore size | Sigma Aldrich | CLS3374 | 본문에서 8 um mesh filter plate |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | 모든 동급 하드웨어 허용 |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33216 | 모든 동급 하드웨어 허용 |
| Vacufuge Concentrator | Eppendorf | 22822993 | 모든 동급 하드웨어 허용 |
| XCell SureLock Mini-Cell 시스템 | ThermoFisher Scientific | EI0001 | 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다 |
| Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | 동등한 하드웨어가 허용됩니다. |
| Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker | GE Healthcare Life Sciences | UVC500-115V | 중단, 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다 |
| . Gel Doc XR+ Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | 텍스트에서 gel imager로 언급 |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR89 | 텍스트에서 UV transilluminator로 언급됨 |
| 초음파 배스 | 브랜소닉 | 1207K35 | 이에 상응하는 모든 초음파 수조를 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Mawy, T. Single-cell sequencing. Nat Methods. 11 (1), 18(2014).
- Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).
- Sasagawa, Y., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
