Cell-based скрининга мышиных поджелудочной островок Diabetogenic окружающей среды химических веществ
Summary
Здесь мы представляем протокол изолировать клетки поджелудочной островок мыши для скрининга ROS индукции, ксенобиотиков с целью выявления потенциальных diabetogenic ксенобиотиков химических веществ.
Abstract
Было установлено, что воздействие некоторых экологических химических веществ у животных и человека вызывают повреждения клеток поджелудочной железы β-клеток, которые приведут к развитию сахарного диабета типа 2 (T2DM). Хотя механизмы для β химико индуцированного повреждения клеток были неясными и может быть сложным, один из повторяющихся выводов является что эти химические вещества вызывают Оксидативный стресс приводит к генерации чрезмерного реактивнооксигенных видов (ров) который вызвать повреждения β-клеток. Для выявления потенциальных diabetogenic окружающей среды химических веществ, мы изолированы поджелудочной островок клеток от мышей C57BL/6 и культивировали островковых клеток в 96-луночных клетки культуры пластин; затем были дозированной островковых клеток с химикатами и поколение ROS был обнаружен 2′ 7′-dichlorofluorescein (DCFH-DA) Люминесцентная краска. С помощью этого метода, мы нашли что бисфенол А (BPA), бензо [а] пирена (БАП) и полихлорированных дифенилов (ПХД), может вызвать высокий уровень рос, предполагая, что они потенциально могут вызывать повреждения в островковых клеток. Этот метод должен быть полезным для скрининга diabetogenic ксенобиотиков. Кроме того искусственный островковых клеток также могут быть приспособлены для анализа в vitro химико индуцированной токсичности в клеток поджелудочной железы.
Introduction
Увеличение распространенности T2DM стали кризис глобального здравоохранения в последние годы, создает серьезную угрозу для общественного здравоохранения1. Многие факторы были найдены каузально связаны с развития T2DM, среди которых, повторяющиеся выводы позволяют предположить, что одной общей конвергентных точки для этих факторов индукции оксидативного стресса, что приводит к генерации чрезмерного Рось-2 , 3.
Было установлено, что широкий спектр окружающей среды химических веществ, включая ПХД, диоксины и BaP вызывают Оксидативный стресс, который может нарушить функции поджелудочной железы β-клеток и привести к сопротивление инсулина и T2DM4. Хотя физиологический уровень рос играет важную роль в клеточных функций, подверженности рос, что превышает емкость антиоксидантной системы приводит к повреждению клеток/тканей и приводит к болезни5. Клетки поджелудочной железы β Экспресс низкий уровень антиоксидантной фермента и таким образом являются чувствительными мишенью для Оксидативный стресс опосредованный ущерб6,7. Было показано, что хроническое воздействие высоких уровней ROS вызвать стресс индуцированного поджелудочной железы клетки дисфункции5 а также сопротивление инсулина в печени и жировой ткани8.
Общая цель этого проекта – разработать на основе ячеек пробирного экрана химических веществ для их diabetogenic потенциалов на основе их индукции рос в клеток поджелудочной железы. Поджелудочной железы не хватает метаболической дезинтоксикации и чувствительных мишенью для ксенобиотик индуцированного повреждения6,7. Таким образом непосредственно измеряя ROS, сгенерирована клеток поджелудочной железы, этот assay должны обеспечивать прямой аппроксимации химико индуцированного повреждения в поджелудочной железе. Развивать этот метод, мы изолированные мыши панкреатических островков, культивированный изолированных островок в условиях культуры клеток с химическими веществами и использовать химико индуцированной поколение ROS как индикация. Эта процедура является простым и эффективным при определении химических веществ заставить ROS в изолированном островке; она может быть дальнейшее развитие для изучения механизмов токсичности, которые являются специфическими для поджелудочной железы в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Накопление доказательств свидетельствует о том, что воздействие окружающей среды химических веществ играет важную роль в развитии T2DM. Ксенобиотиков индуцированной ROS была признана потенциальным этиологического фактора, способствующих развитию T2DM. Люди подвергаются воздействию широ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом пилотного проекта от CREH центра под эгидой NIEHS и Национальный фонд естественных наук Китая (№ 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
