Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.
Abstract
Exposição a certas substâncias químicas ambientais em humanos e animais foi encontrada para causar dano celular das células β do pâncreas que conduzirá ao desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Embora os mecanismos para o danos nas células β induzida em química foram clara e susceptível de ser complexo, uma constatação recorrente é que estes produtos químicos induzem o estresse oxidativo levando a geração de espécies de excessiva reativas de oxigênio (ROS) que induzem danos a célula β. Para identificar potenciais produtos químicos ambientais diabetogenic, isolamos as células de ilhotas pancreáticas de camundongos C57BL/6 e de células da ilhota cultivadas em placas de cultura de células 96 poços; em seguida, as células das ilhotas foram tratadas com produtos químicos e a geração de ROS foi detectada por 2′, tintura fluorescente 7′-diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA). Usando esse método, nós encontrou que o bisfenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) e os bifenilos policlorados (PCBs), poderia induzir altos níveis de ROS, sugerindo que eles podem potencialmente induzir danos nas células das ilhotas. Este método deve ser útil para a seleção diabetogenic xenobióticos. Além disso, as células das ilhotas culta também podem ser adaptadas para análise em vitro de toxicidade induzida por substância química nas células do pâncreas.
Introduction
Aumento na prevalência de T2DM tornaram-se uma crise de saúde global nos últimos anos posando uma séria ameaça à saúde pública1. Muitos fatores foram encontrados para ser causalmente ligada ao desenvolvimento do T2DM, entre os quais, recorrentes achados sugerem que um ponto convergente comuns a esses fatores é a indução de estresse oxidativo, que leva à geração de excessiva ROS2 , 3.
Um amplo espectro de produtos químicos ambientais incluindo PCBs, dioxinas e BaP foi encontrado para induzir o estresse oxidativo, que pode prejudicar a função das células β do pâncreas e levar à resistência à insulina e T2DM4. Embora o nível fisiológico de ROS desempenha um papel importante nas funções celulares, exposição a ROS que excede a capacidade do sistema antioxidante resulta em danos de tecidos/células e leva a doenças5. Células β do pâncreas expressam um baixo nível de enzima antioxidante e assim são um alvo sensível para o dano mediada por estresse oxidativo6,7. A exposição crônica a níveis elevados de ROS foi mostrada para causar disfunção de células pancreáticas induzida por estresse5 bem como resistência à insulina no fígado e tecido adiposo8.
O objetivo geral deste projeto é desenvolver um ensaio baseada em célula de substâncias químicas de tela para seus potenciais de diabetogenic com base na sua indução de ROS em células pancreáticas. O pâncreas carece de desintoxicação metabólica e é um alvo sensível para dano induzido por xenobiótico6,7. Portanto, medindo diretamente o ROS gerado nas células do pâncreas, este ensaio deve fornecer uma aproximação direta da lesão induzida por produto químico no pâncreas. Para desenvolver este método, nós isolado de ilhotas pancreáticas do mouse, culta o ilhéu isolado sob condição de cultura celular com produtos químicos e utilizou a geração de ROS induzida por substância química como a leitura. Este procedimento é simples e eficaz na identificação de produtos químicos ROS-induzindo o ilhéu isolado; Isso pode ser desenvolvido para a investigação dos mecanismos de toxicidade que são específicos para o pâncreas em vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Acumular evidências sugere que a exposição a substâncias químicas ambientais desempenha um papel importante no desenvolvimento do T2DM. Induzida por xenobióticos ROS tem sido reconhecida como um fator etiológico potencial, contribuindo para o desenvolvimento do T2DM. Os seres humanos são expostos a uma ampla gama de produtos químicos xenobióticos e há uma grande necessidade de técnicas de pesquisa de romance para efetivamente identificar os tóxicos do pâncreas e para investigar o mecanismo de toxicidade esp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto piloto do centro CREH patrocinado pela NIEHS e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
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