Summary

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Published: April 25, 2018
doi:

Summary

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Abstract

Bioelektrizität, endogene elektrische Signalisierung von Ionenkanälen vermittelt und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran, spielt eine wichtige Rolle bei der Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen und viele andere biologische Prozesse, wie z. B. embryonale Developmental Musterung. Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für die in Vivo Überwachung elektrische Aktivität in vertebrate Embryogenese. Die Fortschritte der genetisch codierten fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) machten es möglich, eine Lösung für diese Herausforderung zu bieten. Wir beschreiben hier, wie erstelle ich eine transgene Spannung Indikator Zebrafisch mit den etablierten Spannungsanzeige ASAP1 (beschleunigte Sensor von Aktionspotentialen 1), als Beispiel. Das Tol2-Kit und einem allgegenwärtigen Zebrafisch-Promotor, Ubi, wurden in dieser Studie ausgewählt. Wir erklären auch die Prozesse der Gateway ortsspezifische Klonen, Tol2 Transposon-basierte Zebrafisch Transgenese und den imaging-Prozess für Frühphasen-Fisch Embryonen und Fisch Tumoren mit regelmäßigen Epifluorescent Mikroskope. Mit diesem Fisch-Linie, fanden wir, dass während der Embryogenese Zebrafisch und Fische Larven Bewegung gibt es zelluläre elektrische Spannungsänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in ein paar Zebrafisch malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren, Tumor, die Zellen in der Regel polarisiert waren im Vergleich zu das umliegende normale Gewebe.

Introduction

Bioelektrizität bezieht sich auf endogene elektrische Signalisierung durch Ionenkanäle und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran1vermittelt. Ionischen Austausch über die Zellmembran und die gekoppelten elektrischen potenziellen und aktuellen Änderungen sind unerlässlich für die Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen. Bioelektrizität und Ion Steigungen haben darüber hinaus eine Vielzahl von anderen wichtigen biologischen Funktionen wie Energiespeicher, Biosynthese und Metabolit Transport. Bioelektrische Signale wurde auch als Regulator des embryonalen Musterbildung wie körperachsen, Zellzyklus und Zelle Differenzierung1entdeckt. Daher ist es wichtig für das Verständnis der vielen menschlichen Erbkrankheiten, die sich aus der MIS Verordnung dieser Art der Signalisierung. Obwohl Patch-Clamp ist weit verbreitet für die Aufnahme einzelner Zellen, ist es immer noch bei weitem nicht Ideal für die gleichzeitige Überwachung mehrerer Zellen während der Embryonalentwicklung in Vivo. Darüber hinaus sind sensible kleine Moleküle Spannung auch nicht ideal für in-Vivo Anwendungen aufgrund ihrer Besonderheiten, Empfindlichkeiten und Toxizitäten.

Die Schaffung einer Vielzahl von genetisch codiert fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) bietet einen neuen Mechanismus, um dieses Problem zu umgehen, und ermöglicht die einfache Anwendung, Embryonalentwicklung, zu studieren, obwohl sie ursprünglich, für die Überwachung der neuronalen bestimmt waren 2,3Zellen. Eines der derzeit verfügbaren GEVIs ist die beschleunigte Sensor Aktionspotentiale 1 (ASAP1)4. Es besteht aus einer extrazellulären Schleife einer Spannung-sensing Domäne Spannung empfindlich Phosphatase und ein Zirkular permutierte grün fluoreszierendes Protein. Daher erlaubt ASAP1 Visualisierung der elektrische mögliche Zellveränderungen (Polarisation: hellgrün; Depolarisation: dunkelgrün). ASAP1 hat 2 ms ein- und Kinetik und Eingangssignale mögliche Änderung4verfolgen können. So ermöglicht dieses genetische Tool für ein neues Maß an Effizienz in bioelektrische Echtzeitüberwachung in lebenden Zellen. Weitere Verständnis der Rollen der Bioelektrizität in der embryonalen Entwicklung und vielen menschlichen Krankheiten wie Krebs, wird werfen ein neues Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die für Behandlung und Prävention von entscheidender Bedeutung ist.

Zebrafisch nachweislich eine leistungsstarke Tiermodell, Entwicklungsbiologie und menschliche Krankheiten einschließlich Krebs5,6zu studieren. Sie 70 % ortholog Gene mit Menschen teilen, und sie haben ähnliche vertebrate Biologie7. Zebrafisch bieten relativ pflegeleicht, eine große Kupplung Größe von Eiern, gefügig Genetik, leicht Transgenese und transparente externe embryonale Entwicklung, wodurch sie ein überlegenes System für in-Vivo imaging5,6. Eine bedeutende Quelle von mutant Fisch Linien bereits vorhanden und ein vollständig sequenzierte Genom wird Zebrafisch relativ unbegrenzt vielfältige wissenschaftliche Entdeckungen bieten.

Um die in Vivo in Echtzeit elektrische Aktivität von Zellen zu untersuchen, nutzen wir die Zebrafisch Modellsystem und ASAP1. In diesem Papier wir beschreiben, wie das Zebrafish Genom Tol2 Transposon Transgenese mit fluoreszierenden Spannung Biosensor ASAP1 einzubauen, und elektrische Zellaktivität zu visualisieren, während der Embryonalentwicklung, Fische Larven Bewegung, und im live tumor .

Protocol

Der Zebrabärbling in eine AAALAC genehmigt Tierstation untergebracht sind, und alle Versuche erfolgten nach den Protokollen von Purdue Animal Care und Nutzung Committee (PACUC) genehmigt. 1. Tol2 Transposon Plasmid Konstrukt Vorbereitung Hinweis: Tol2, ein Transposon, das Medaka Fisch entdeckt wurde hat in der Zebrafisch Forschung Gemeinschaft8,9verbreitet wurde. Es wurde erfolgreich an das Gateway ortsspezif…

Representative Results

In einer erfolgreichen Injektion, mehr als 50 % injiziert Fischembryonen zeigt ein gewisses Maß an grünen Fluoreszenz in den somatischen Zellen, und die meisten von ihnen werden positiv von Tol2 Transposon Verbrauchsteuern Assay (Abbildung 2). Nach 2-4 Generationen von Out-Kreuz mit Wildtyp-Fisch (bis der fluoreszierenden Fisch 50 %, die erwarteten Mendelian Verhältnis erreichen), wurden die transgene Fische für das imaging Experiment zur Zellmembran Pote…

Discussion

Obwohl die Mobilfunk- und Gewebe elektrische Aktivitäten während der embryonalen Entwicklung und Krankheit beim Menschen vor langer Zeit entdeckt wurden, bleiben die in Vivo dynamische elektrische Veränderungen und deren biologische Rollen noch weitgehend unbekannt. Eine der großen Herausforderungen ist zu visualisieren und zu quantifizieren, die elektrischen Veränderungen. Patch-Clamp-Technologie ist ein Durchbruch für die Verfolgung von Einzelzellen, aber seine Anwendung auf vertebrate Embryonen ist begr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschungsarbeit, die in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health Award Anzahl R35GM124913, Purdue University PI4D Incentive-Programm und PVM internen Wettbewerb unterstützt. Grundlagenforschung-Fonds-Programm. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der finanziellen Mittel. Wir danken für das Konstrukt Tol2, Michael Lin für das Konstrukt ASAP1 Koichi Kawakami und Leonard Zon für die Ubi -Promoter zu konstruieren, durch Addgene.

Materials

14mL cell culture tubes VWR 60818-725 E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank Thermo Scientific Owl B2 DNA eletrophoresis
Agarose RA Amresco N605-500G For making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primer IDT DNA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primer IDT DNA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scope Nikon SMZ 745 Dechorionation, microinjection, mounting
Color camera Zeiss AxioCam MRc Fish embryo image recording
Concave slide VWR 48336-001 For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 ml Thermo Scientific 13-711-9AM Fish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not I NEB R0189L For linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scope Zeiss Axio Imager.A2 Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scope Zeiss Stereo Discovery.V12 Fish embryo imaging
Fluorescent light source Lumen dynamics X-cite seris 120 Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5 WPI 500342 Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Scientific 11789020 Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme Thermo Scientific 12538120 Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002 DNA gel purification
Loading tip Eppendorf 930001007 For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs) Alfa Aesar 43146 Fish embryo mounting
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
Microinjector WPI Pneumatic Picopump PV820 Microinjection injector
Micro-manipulator WPI Microinjector mm33 rechts Microinjection operation
Micropipette puller Sutter instrument P-1000 For preparing capillary needle
Mineral oil Amresco J217-500ml For calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Thermo Scientific AM1340 mRNA in vitro transcription
Monocolor camera Zeiss AxioCam MRm Fish embryo image recording
Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4020 Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishes VWR 25384-088 For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 mRNA cleaning after in vitro transcription
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000 For measuring DNA and RNA concentrations
Stage Micrometer Am Scope MR100 Microinjection volume calibration
Thermocycler Bio-Rad T100 DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillaries WPI TW100F-4 Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primer IDT DNA GCACAACACCAGAAATGCCCTC Tol2 excise assay
Tol2-exR primer IDT DNA ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG Tol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coli Thermo Scientific C404006 Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylate Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nm UVP M-20V DNA visualization
Water bath Thermo Scientific 2853 For transformation process of gene cloning

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Cite This Article
Silic, M. R., Zhang, G. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (134), e57330, doi:10.3791/57330 (2018).

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