Summary
هنا يمكننا وصف الإجراء كانالوستومي الذي يتيح إيصال الأدوية المحلية إلى آذان الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة من خلال القناة نصف دائري مع الحد الأدنى من الأضرار الداخلية للوظيفة السمعية والدهليزيه. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتطعيم النواقل الفيروسية، والمستحضرات الصيدلانية، والجزيئات الصغيرة في الإذن الداخلية الماوس.
Abstract
التسليم المحلي للعقاقير العلاجية في الإذن الداخلية علاج واعدة لأمراض الإذن الداخلية. حقن من خلال القنوات نصف دائري (كانالوستومي) تبين أن يكون نهجاً مفيداً لإيصال الأدوية المحلية إلى الإذن الداخلية. والهدف من هذه المادة لوصف بالتفصيل، التقنيات الجراحية المعنيين في كانالوستومي في الفئران كل من الكبار والأطفال حديثي الولادة. كما أشارت بصبغ الأخضر سريع والمرتبطة بالغدة الفيروس النمط المصلي المسيطر 8 مع الجينات البروتينات الفلورية الخضراء، سهلت كانالوستومي التوزيع الواسع لحقن المواد الكاشفة في القوقعة وأجهزة نهاية الدهليزية مع الحد الأدنى من الضرر للسمع و الوظيفة الدهليزية. نفذت بنجاح عملية جراحية في الفئران كل من الكبار والأطفال حديثي الولادة؛ وفي الواقع، يمكن أن يكون إجراء عملية جراحية متعددة إذا لزم الأمر. وفي الختام، كانالوستومي هو نهج فعالة وآمنة لإيصال الأدوية إلى آذان الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة، ويمكن استخدامها لعلاج أمراض الإذن الداخلية البشرية في المستقبل.
Introduction
الحسي في الاستماع إلى الخسارة والدهليزيه خلل يؤثر على عدد كبير من المرضى، وهي وثيقة المرتبطة باضطرابات الإذن الداخلية. توصيل الأدوية العلاجية في الإذن الداخلية يبشر بالخير لعلاج اضطرابات الإذن الداخلية. يمكن استخدام نهج النظام أو المحلية توصيل العقاقير إلى الإذن الداخلية. وتعامل بعض أمراض الإذن الداخلية بنجاح مع إدارة المخدرات الجهازية، مثل فقدان السمع المفاجئ مجهول السبب، التي يتم التعامل عادة مع الجهازية ستيرويد1. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت لينتز et al. أن الإدارة المنهجية للعقاقير اليغنوكليوتيد قادرة على تحسين السمع والتوازن بين وظائف في النموذج2الماوس متحولة Ush1c. بيد أن جزءا كبيرا من أمراض الإذن الداخلية لا فعالية تعامل إدارة المخدرات الجهازية بسبب حاجز الدم-متاهة، مما يحد من وصول المخدرات إلى الإذن الداخلية3،4. وفي المقابل، استراتيجيات تسليم المخدرات المحلية يمكن علاج اضطرابات الإذن الداخلية أكثر كفاءة. وفي الواقع، الإذن الداخلية يحتمل أن تكون هدفا مثاليا لإيصال الأدوية المحلية؛ أنه مليء بالسوائل، مما ييسر نشر المخدرات بعد نشر موقع واحد أو الحقن، وأنها معزولة نسبيا من الأجهزة المجاورة، مما يحد من الآثار الجانبية5،6.
وتشمل استراتيجيات تسليم المخدرات المحلية أساليب إينتراتيمبانيك وإينترالابيرينثيني. فعالية المسار إينتراتيمبانيك يعتمد إلى حد كبير على نفاذية المخدرات من خلال نافذة جولة الغشاء (روم) وفترة الإقامة من المخدرات في روم3،4،،من78. وهكذا، أنها ليست مناسبة لإيصال المخدرات أو المواد الكاشفة التي لا يمكن اختراق في روم. أساليب إينترالابيرينثيني تشمل التطعيم للمخدرات مباشرة في الإذن الداخلية، نتج عنه جرعة عالية وتوزيعها على نطاق واسع. ومع ذلك، أساليب إينترالابيرينثيني تتطلب العمليات الجراحية الدقيقة والغازية، مما أدى إلى إلحاق الضرر بوظيفة الإذن الداخلية. حاليا، يتم استخدام حقن المخدرات إينترالابيرينثيني فقط في الدراسات الحيوانية كما أنه لم يثبت أن تكون آمنة بما فيه الكفاية لاستخدامها في البشر9. ولذلك، يجب تبسيط الإجراءات الجراحية، وتقليل مخاطر الإصابة بترجمة النهج إينترالابيرينثيني في العيادة.
وقد قسمت عدة نهج إينترالابيرينثيني في الحيوانات بالحقن من خلال ال10،،من5روم11 وفي سكالا وسائل الإعلام12،،من1314، حبل سكالا 15 , 16و الدهليز سكالا17والقنوات نصف دائري16،،من1819،20و كيس اندوليمفاتيك21. كل من هذه النهوج على مزايا وعيوب6. يتم التسليم عن طريق روم أتراوماتيك في الفئران حديثي الولادة5،22. ومع ذلك، لوحظ فقدان السمع معتدل في الفئران الكبار بعد روم حقن23، ربما بسبب انصباب الإذن الوسطى بعد الجراحة24. حقن وسائل الإعلام سكالا، الذي ينطوي على حقن الكاشف مباشرة إلى الفضاء اندوليمفاتيك التي تحتوي على ظهارة الحسية، يحقق كاشف عالية تركيز في الهدف أجهزة نهاية12،14، 25 , 26-ومع ذلك، هذا النهج يتطلب إجراءات معقدة ويؤدي ارتفاع كبير على عتبة السمع إذا أجرى في وقت لاحق من اليوم بعد الولادة 5 (P5)25،27، مما يحد من تطبيقه.
مقارنة النهج إينترالابيرينثيني المشار إليها أعلاه، كانالوستومي يسبب الحد الأدنى من الضرر للإذن الداخلية، لا سيما في الفئران الكبار16،18،28،،من2930، مهمة لتقييم تأثيرات واقية وجوانب متعدية الجنسيات. وعلاوة على ذلك، تقع القنوات نصف دائري في القوارض، خارج الفقاعة، مما يسهل الإجراءات الجراحية ويتجنب حدوث اضطراب الإذن الوسطى أثناء الجراحة. في العيادة، تستخدم القناة نصف دائري العمليات الجراحية المستعصية الدوار الموضعية الانتيابي الحميد31،32،33، مما يوحي بإمكانية كانالوستومي السريرية. نظراً لأنه أول وصف كاواموتو et al. وقد استخدم 16 في عام 2001، كانالوستومي لتوفير الكواشف المختلفة، مثل امينوغليكوزيد، والخلايا الجذعية، النواقل الفيروسية و siRNA إلى الإذن الداخلية موريني18،،من1928،29 ،34،35،،من3637. تطعيم نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) التي كانالوستومي تمكين overexpression جينات الخارجية في ظهارة الحسية والخلايا العصبية الأولية القوقعة وأجهزة نهاية الدهليزية18،28، 29،30. ويرلين العلاج الجيني كانالوستومي باستعادة وظيفة التوازن ويحسن السمع في طراز ماوس البشري تستهل متلازمة19، مما يوحي بأن كانالوستومي مفيد للدراسات المتعلقة بالعلاج الجيني للأمراض الوراثية كوتشليوفيستيبولار. زرع الخلايا الجذعية الوسيطة التي كانالوستومي النتائج في إعادة تنظيم cochlear فيبروسيتيس واستعادة السمع في نموذج الفئران من فقدان السمع الحسي الحاد35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام كانالوستومي لإدخال الامينوجليكوزيدات في الإذن الداخلية وضع آفات الدهليزية18،،من3438، ويمكن إجراء حقن متعددة إذا لزم الأمر18 , 34.
في هذه المادة، يصف لنا، بالتفصيل، تقنيات كانالوستومي في الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة. نحن تلقيح الكواشف المختلفة، بما في ذلك صبغ الأخضر سريع والنمط المصلي المسيطر إف 8 (AAV8)، إلى جانب الجينات البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) (AAV8-التجارة والنقل) وستربتوميسين، في الإذن الداخلية الماوس على تقييم نتائج فورية وطويلة الأجل بعد كانالوستومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات والعمليات الجراحية الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة الجامعة الطبية رأس المال في الصين.
1-جهاز الأعمال التحضيرية
- لجعل قنية الحقن (الشكل 1A)، قم بتوصيل أنابيب بوليميد (القطر الداخلي 114.3 ميكرومتر، القطر الخارجي 139.7 ميكرومتر، طول ~ 3 سم) لأنابيب البولي إيثيلين (القطر الداخلي 280 ميكرومتر، القطر الخارجي 640 ميكرومتر، طول ~ 40 سم). استخدام superglue، ختم الاتصال مع التطبيقات الثلاثة على الأقل. تعقيم قنية الحقن مع أكسيد الإيثيلين.
ملاحظة: عند إغلاق الأنبوب، منع superglue من دخول الأنبوب بوليميد، مما يؤدي إلى انسداد القنية. ختم الأنابيب في أقل من ثلاث مرات، لأن التعقيم الغاز قد يتسبب التسرب في الاتصال. - باستخدام إبرة 30 غ، الاتصال نهاية الأنبوب البولي إثيلين 1 cc حقنه تحتوي على المحلول الملحي العادي. تعبئة القنية مع المحلول الملحي العادي عن طريق الحقن بحقنه 1-cc للتحقق من وجود أي تسرب أو انسداد في الاتصال بين بوليميد الأنابيب وأنابيب البولي إيثيلين.
ملاحظة: إذا كان هناك تسرب أو انسداد للاتصال، لا يمكن استخدام القنية في الإجراءات التالية. - إخلاء 10 ميليلتر الصغرى-حقنه مع المحلول الملحي العادي وتوصيله بإبرة ز 30 المذكورة آنفا مع قنية الحقن. تثبيت الصغرى-المحاقن في مضخة microinjection (الشكل 1B). تعيين سرعة الحقن إلى 0.5 ميليلتر/دقيقة والحجم إلى 1 ميليلتر لصبغ الأخضر سريع و AAV8-التجارة والنقل، أو 2 ميليلتر والستربتوميسين.
ملاحظة: النطاق الموصى به للحقن بسرعة هو 0.1−0.5 ميليلتر في الدقيقة، ومدى حجم الحقن الموصى به هو ميليلتر 0.5−2. - الانسحاب الجزئي-المحاقن إلى 1 ميليلتر واستخراج الكاشف الحقن. وسوف تشكل فجوة في هواء بين المحلول الملحي العادي والكاشف حقن (الشكل 1).
- بشكل اختياري تسمية موقف الحدود الغاز السائل في الأنبوب البولي إثيلين باستخدام قلم ماركر. وهذا يمكن استخدامها لمراقبة تدفق الكاشف أثناء الحقن.
2-كانالوستومي في الفئران الكبار
- تخدير ماوس الكبار (الإناث، ففب/N، 5 إلى 6-أسبوع من العمر) عن طريق الحقن داخل الكيتامين HCl (120 ملغ/كغ) و xylazine HCl (7 مغ/كغ). انتظر دقيقة 5−10 حتى الحيوان والمعارض لا الاستجابة للمحفزات مؤلمة (منعكس تو-رشة). ضع الحيوان على لوح كهربائية مسخن بعد التخدير. مسكن، ميلوكسيكام (1 مغ/كغ)، وقد طبقت تحت الجلد قبل الجراحة.
- تغطية عيون الحيوان مع مرهم العين. حلاقة المنطقة بعد إذني اليسرى مع ماكينة كهربائية حيوان وتطهير الجلد ثلاث مرات مع الإيثانول 75%.
- مكان الحيوان على منصة كهربائية مسخن. ضبط درجة حرارة لوحة المفاتيح الكهربائية إلى ~ 37 درجة مئوية. وضع الحيوان في الموضع الأفقي الحق تيسيرا لعملية جراحية في أذنه اليسرى.
- جعل شق إذني بعد 1-1.5-سم ~ 3 مم من الاخدود ريترووريكولار اليسرى (الشكل 2A).
- المواقع الخلفية نصف دائري قناة (PSC) وقناة نصف دائري الأفقي (المهارات): عندما يتم تعريف جذر بينا (دوت جريئة في الشكل 2) كالأصل والطائرة موازية كالفاريوم ك 3 إلى 09:00 ص، (PSC) والمهارات عادة يقع ~ 3 مم من جذر بينا بين 2 و 03:00 ص (الشكل 2).
- صراحة تشريح العضلات تغطي العظم الصدغي مع الملقط الصغير لكشف PSC والمهارات، الهوامش التي تكون مرئية بوضوح كالظلام المشارب في العظم الصدغي (الشكل 2). المهارات في حوالي 30° زاوية من الطائرة موازية كالفاريوم، ومجلس السلام والأمن بشكل عمودي للمهارات (الشكل 2). جمع قطعة صغيرة من العضلات بالملقط الصغير وأتركها تجف. في الخطوة التالية، سيتم استخدام هذه العضلات لإغلاق الثقب.
ملاحظة: تجنب تمزق المفرط في الأنسجة لتقليل الإصابة بالعضلات. تجنب إتلاف السفينة المجاورة عند تعريض PSC (الشكل 2D). - جعل ثقب صغير في الجزء الأوسط من PSC استخدام إبرة ز 26 (الشكل 2D). تسرب السوائل من خلال الثقب يشير إلى نجاح اختراق الجدار عظمى من PSC. توسيع الحفرة إلى حجم مناسب، أكبر قليلاً من قطر الأنبوب بوليميد.
ملاحظة: حفر وتوسيع الثقب بلطف وتدريجيا لتجنب كسر PSC. - تنظيف انصباب المحيطة بالحفرة PSC استخدام بيليه القطن.
- إدراج غيض أنابيب بوليميد برفق في ال PSC تجاه بلده ساق إلى عمق 1−2 ملم (الشكل 2E). بدء الحقن بالضغط على الزر 'تشغيل' على المضخة.
- بعد الحقن، انتظر ~ 2 دقيقة للسماح للكاشف لنشر. قم بقطع قطعة صغيرة من العضلات التي تم جمعها في الخطوة 2، 6 مع المقص الصغير. بعد ذلك، إزالة قنية الحقن وفورا وضع العضلات في الحفرة في مجلس السلام والأمن.
ملاحظة: التحقق من وجود أي السائل المتسرب من الحفرة بعد توصيل لضمان أن الحفرة مغلقة تماما. - العودة فصل العضلات والأنسجة تحت الجلد. خياطة شق استخدام خياطة 5-0. تطهير منطقة شق مع اليود البوفيدون.
ملاحظة: جميع الإجراءات الجراحية المذكورة أعلاه يستغرق حوالي 25 دقيقة. - موقف الحيوان على منصة كهربائية يسخن إلى ~ 37 درجة مئوية. وضع الحيوان في الموضع الأفقي الحق للانتعاش.
- إجراء قياسات استجابة (ABR) جذع الدماغ السمعية والسباحة الاختبارات بعد الجراحة18أسبوع.
- إذا لزم الأمر، إجراء الحقن المتكررة في منطقة مختلفة من PSC أو المهارات.
3-كانالوستومي في الفئران حديثي الولادة
- استخدام انخفاض درجة حرارة الجسم للحث والمحافظة على التخدير في الفئران حديثي الولادة (ففب/N) في الأيام التالية للولادة 1 إلى 2 (P1-2). ضع ألجرو على سرير من الثلج المجروش لمدة دقيقة ~ 4 التفاف المغطاة من البلاستيك. وبعد ذلك، تكمن ألجرو على منصة مليئة بالجليد. تطهير ميدان العمليات الجراحية ثلاث مرات مع الإيثانول 75%.
ملاحظة: تأكد من أن رأس ألجرو الخروج من الجليد. إجراء عملية جراحية كاملة مع ألجرو على منصة مليئة بالجليد. - تختلف الخطوات التالية في الوليد بالمقارنة مع الفئران الكبار.
- جعل شق بوستاوريكولار ~ 3 مم من ~ 2 مم الخلفي تجعد إذني (الشكل 3 ألف -ب).
- بلطف قم بفتحه في ال PSC لينة باستخدام إبرة ز 26. إدراج القنية PSC دون توسيع فتح (الشكل 3 -E).
- بعد الحقن، استخدم قطعة من العضلات لتغطي، بدلاً من سد العجز، فتح هذا الأخير يمكن أن يؤدي إلى كسر من PSC الناعمة (3F الشكل).
- إغلاق الجلد باستخدام خياطة 6-0.
- إجراء قياسات ABR والسباحة الاختبارات في P3030.
- أكل لحوم البشر الأبوية مشكلة مشتركة بعد جراحة الأطفال حديثي الولادة. الخطوات التالية التي تقلل من احتمال الأبوية أكل لحوم البشر.
- تنظيف الدم المحيطة بالشق مع مناديل الكحول بعد الجراحة.
- ضمان أن الوليد يمكن أن تتحرك بحرية قبل العودة إلى السد.
- تشويه المواليد الجدد مع الأسرة المتسخة من قفص الأم، ومكان الولدان مرة أخرى في وسط القمامة.
- يجب أن تتلقى أي التي لا تخضع لعملية جراحية شق بوستاوريكولار مماثلة وخياطة الجروح.
- فصل الذكر من قفص تربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان حقن صبغة سريعة والأخضر في ال PSC الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة لتقييم توزيع فوري في الإذن الداخلية. تم الكشف عن الصبغ طوال القوقعة والدهليز والقنوات نصف دائري فورا بعد الجراحة (الشكل 4).
لتقييم سلامة وكفاءة كانالوستومي لإيصال الجينات الإذن الداخلية، تم حقن AAV8-التجارة والنقل في الإذن الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة. أظهر جميع الحيوانات العادية عتبات ABR والسباحة درجات الاختبار بعد AAV8-بروتينات فلورية خضراء حقن18،30. وكشف إيمونوهيستولوجي، في ظهارة الحسية السمعية، خلايا الشعر الداخلية (إيكس) وخلايا الشعر قليلة الخارجي (أوهكس) بدوره القاعدية وأظهر قوية التعبير بروتينات فلورية خضراء30. في ظهارة الحسية الدهليزية، تم الكشف عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في30أوتريكلي وساككولي وأمبولي. وقد ترانسدوسيد خلايا الشعر الدهليزية (الشكل 5) والخلايا الداعمة بكفاءة عالية18،30.
ضخ ستربتوميسين كانالوستومي يدفع خسارة شديدة الشعر خلية في34،3818،أوتريكلي. وأعطيت الفئران لاختبار جدوى حقنات متعددة عبر كانالوستومي، ستربتوميسين من خلال المهارات تليها 7 أيام بعد تعليق AAV8-التجارة والنقل من خلال مجلس السلام والأمن. كما صمم هذه التجربة لتقييم خصائص توصيل AAV8-التجارة والنقل في أوتريكلي ليسيونيد، الذي كان مفيداً لدراسات العلاج الجيني في الإذن الداخلية التالفة بعد HC خسارة18. بروتينات فلورية خضراء وزعت في جميع أنحاء أوتريكلي ليسيونيد (الشكل 6). الخلايا بروتينات فلورية خضراء-إيجابية عديدة كانت سلبية بالنسبة الميوسين VIIA، مشيراً إلى أنهم كانوا ترانسدوسيد المنبوذة. وأعرب HCs قليلة (الميوسين VIIa-إيجابية الخلايا) مع حزم الشعر غير ناضجة أيضا عن التجارة والنقل.
رقم 1: إعداد الجهاز. (أ) مختومة أنابيب بوليميد (ط) وأنابيب البولي إيثيلين (الثاني) جعل حقن قنية (ثالثا). (ب) متصلاً 10 ميليلتر الصغرى-حقنه بإبرة ز 30 القنية وثم تثبيتها على مضخات. يشير السهم إلى نصيحة القنية. (ج) حقن الكاشف والمحلول الملحي العادي مفصولة بفجوة في هواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: كانالوستومي في ماوس الكبار. (أ) شق إذني بعد (السهم). (ب) يتعرض العضلات التي تغطي العظم الصدغي. إذا كان علينا أن نحدد جذور بينا (نقطة غامق) كالأصل والطائرة موازية كالفاريوم ك 3/9 مساء، قناة نصف دائري الخلفي (PSC) وقناة نصف دائري الأفقي (المهارات) وتقع عموما في المنطقة بين 2 و 03:00 ص (الخماسي) ، ~ 3 مم من الأصل. اقحم: الصورة السفلية-التكبير التوجه. خط منقط يشير إلى أن الطائرة كالفاريوم. (ج) PSC والمهارات هي المكشوفة (الخطوط المنقطة). داخلي: المهارات في حوالي 30° زاوية من الطائرة موازية كالفاريوم، ومجلس السلام والأمن بشكل عمودي للمهارات. (د) اعتماد ثقب صغير في مجلس السلام والأمن. (ﻫ) غيض القنية ويتم إدراج مجلس السلام والأمن، ويتم حقن الكاشف. (و) الحفرة مختومة مع قطعة صغيرة من العضلات. شريط مقياس في A هو 5 مم، موجود في ب 1 مم (ب لباء-واو)، التي في تدرج إلى ب 1 سم، وهي التي في تدرج إلى ج 5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: كانالوستومي في ماوس الولدان. (أ) بعد إذني شق (السهم). (ب) تعرض العضلات التي تغطي العظم الصدغي، والقناة نصف دائري الخلفي (PSC) ~ 2 مم من جذر بينا (نقطة غامق) في 2--03:00 ص (الخماسي). التوجه مطابق في الفئران الكبار (الشكل 2). (ج) PSC وقناة نصف دائري الأفقي (المهارات) هي المكشوفة (الخطوط المنقطة). (د) اعتماد فتحه صغيرة في مجلس السلام والأمن. (ﻫ (القنية ويتم إدراج PSC. (و) قطعة صغيرة من العضلات يستخدم لتغطية الافتتاح بعد الحقن. تغيير حجم أشرطة في ألف واقحم ب 5 ملم، أي في ب 1 ملم، وأن في ج 1 مم (C لج-F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ستيريو الصور المجهرية للاذنين الداخلية للكبار (A-A ') والفئران حديثي الولادة (ب-ب') التي تديرها صبغ الأخضر السريع عن طريق كانالوستومي. وقد جمعت العينات مباشرة بعد الجراحة. (ب) سطح خارج القحف. (أ ' و ب) السطح داخل الجمجمة. الصبغ الأخضر سريع توزع في جميع أنحاء القوقعة والدهليز والقنوات نصف دائري. أشرطة مقياس من 1 ملم (A 'ل A-أ' و ب بب '). PSC، الخلفي نصف دائري القناة. احلركه، الأفقي نصف دائري القناة. التعاون بين بلدان الجنوب، متفوقة نصف دائري القناة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الصور [كنفوكل] الممثل يتصاعد كله القوقعة (أ-أ ") وأوتريكلي (ب-B") من الفئران الكبار، أعدت 30 يوما بعد حقن AAV8-التجارة والنقل عن طريق كانالوستومي- عينات ملطخة بالأجسام المضادة للتجارة والنقل (الأخضر) والميوسين VIIa (أحمر). (أ-أ ") يتم التعبير عن التجارة والنقل في خلايا الشعر الأكثر الداخلية (المدينة). (ب-B ") في المستوى البؤري للوحة كوتيكولار أوتريكلي، أعرب العديد من خلايا الشعر عن التجارة والنقل (الأسهم). التجارة والنقل، بروتين فلوري أخضر. والنشرمحفوظه، خلايا الشعر الخارجي. أشرطة مقياس هي 25 ميكرومتر (A "لألف-ألف"، ب "ب-باء"). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: الحصول على صور [كنفوكل] الممثل من utricle صدمات 30 يوما بعد حقن AAV8-التجارة والنقل عن طريق كانالوستومي- تم حقن ماوس الكبار مع ستربتوميسين عبر قناة نصف دائري الأفقي و 7 أيام بعد حقن AAV8-التجارة والنقل عبر قناة نصف دائري الخلفي. التجارة والنقل (الأخضر)، الميوسين VIIa (أحمر)، واكتين (أزرق). رؤوس الأسهم تشير إلى الخلايا الداعمة الممثل ترانسدوسيد مع AAV8-التجارة والنقل (بروتينات فلورية خضراء + الميوسين الخلايا VIIa)، وتشير الأسهم إلى خلايا الشعر الممثل ترانسدوسيد مع AAV8-التجارة والنقل (بروتينات فلورية خضراء + الميوسين VIIa + خلايا) مع حزم الشعر غير ناضجة. هو مقياس بار 20 ميكرومتر (د أ-د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واظهرنا في هذه الدراسة، أن تسليم المخدرات التي كانالوستومي أدى إلى توزيع واسع النطاق للكاشف طوال القوقعة وأجهزة نهاية الدهليزية. كطريقة إيصال جينات إذن الداخلية، أدى كانالوستومي تعبير بروتينات فلورية خضراء في الأذنين الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة مع الحد الأدنى من الضرر للوظيفة السمعية والدهليزيه. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة إجراء حقنات متعددة في الحيوان نفسه.
واحدة من أعظم مواطن القوة في كانالوستومي هو أنه يؤدي إلى الحد الأدنى من الضرر لوظيفة الإذن الداخلية، ولا سيما في الفئران الكبار16،18،28،،من2930، وهامة بالنسبة تقييم آثار واقية، وجوانب متعدية الجنسيات. واستخدمت عدة مجموعات كانالوستومي لتوفير الكواشف المختلفة، مثل امينوغليكوزيد، والخلايا الجذعية، النواقل الفيروسية و siRNA إلى الإذن الداخلية مورين18،19،،من2829، 34،35،،من3637. في الدراسة الحالية، ووصفت لنا التقنيات الجراحية المفصلة خطوة بخطوة، ومن كانالوستومي في الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة. بالمقارنة مع الدراسات السابقة، دراستنا يوفر تفاصيل إضافية حول تحديد المواقع للقنوات نصف دائري، وهو إجراء رئيسي لعملية جراحية ناجحة. كما هو مبين في الشكل 2 وج، PSC واحلركه كانت تقع عموما ~ 3 مم من جذر بينا في 2--03:00 ص. المهارات كان في حوالي 30° زاوية من الطائرة موازية كالفاريوم، وكان ال PSC الرأسي للمهارات. وعلاوة على ذلك، نحن تبسيط الإجراءات الجراحية، وتقصير وقت الجراحية لحوالي 25 دقيقة مع نتائج مماثلة29.
أثناء كانالوستومي، من الضروري تجنب التسرب في موقع الحقن وانسداد القنية. قبل تبديل المضخة، من المهم لضمان أن يتم إدراج تلميح القنية في القناة نصف دائري وأن القنية لا بنت أو حظر. العضلات الجافة هو الموصى باستخدامها عند إغلاق الثقب في القناة نصف دائري من الفئران الكبار نظراً لحضور نصف دائري قناة السائل، فإنه يوسع والمقابس الحفرة (راجع الخطوات 2.6 و 2.10). نظراً لأن جدار القناة نصف دائري من الفئران حديثي الولادة لينة وهشة، ينبغي مختومة فتح التي تغطي العضلات الغازي أو الغراء الطبي30. ونحن أيضا إزالة القنية دون تغطية الافتتاح مع العضلات؛ النتائج كشفت المقارنة إف توصيل كفاءة في الإذن الداخلية (البيانات لا تظهر)، مشيراً إلى أنه تم إغلاق فتح في مجلس السلام والأمن للفئران حديثي الولادة مرض.
وثمة ميزة أخرى من كانالوستومي هو جدوى إجراءات متعددة، مما يتيح للطلبات المتكررة من الكواشف نفس أو مختلفة (الشكل 6). لأن تليفية وتحبيب الأنسجة وكثيراً ما توجد في مواقع العمليات الجراحية السابقة، وقد عرقلت القناة نصف دائري بعد الجراحة34، ومن المستحسن القيام بالحقن خلال العمليات الجراحية المتكررة في منطقة مختلفة من الجانبية و/أو القنوات نصف دائري الخلفي18.
القيد الرئيسي من كانالوستومي هو الصعوبة في تحديد ما إذا كان يتم إدراج قنية الحقن في الفضاء بيريليمفاتيك أو اندوليمفاتيك. بعد إدارة ناقلات أدينوفيرال في الإذن الداخلية16 عبر كانالوستومي، تقع معظم الخلايا ترانسدوسيد بيريليمفاتيك في الفضاء، مما يوحي بأن الحقن من المحتمل القيام بها في هذا المجال. مركبات الوزن الجزيئي المنخفض (مثلاً، إف، ستربتوميسين، و siRNA) يمكن المرور عبر الحاجز بين بيريليمف واندولمف وتصل إلى ظهارة الحسية بعد حقن في الفضاء بيريليمفاتيك أو اندوليمفاتيك18،19 ،34. ومع ذلك، بعد الحقن إلى perilymph، قد تظل الكواشف في الفضاء بيريليمفاتيك إذا كانوا لا يمكن اختراق الحاجز بين بيريليمف واندولمف39،،من1640. ولذلك، ينبغي النظر في نفاذية الكواشف حقن قبل استخدام كانالوستومي.
وفي الختام، نتائج كانالوستومي في توزيع واسع للمواد الكاشفة في القوقعة والدهليز مع الحد الأدنى من اضطراب في الوظيفة السمعية والدهليزيه. وينفذ عملية جراحية بسهولة في الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة، ويمكن تنفيذ إجراءات متعددة إذا لزم الأمر. كانالوستومي ومن ثم اتباع نهج فعالة وآمنة لإيصال الأدوية إلى الإذن الداخلية من القوارض ويجوز استخدامها في المستقبل، سريرياً لعلاج الأمراض البشرية كوتشليوفيستيبولار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم تعريف لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (أرقام المنح 81570912، 81771016، 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
