Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie
Summary
Tissue-Engineering Nierenfunktion Konstrukte bieten eine Lösung für den Organmangel und die schädlichen Wirkungen der Dialyse. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Mikro murine Nieren zur Isolation von Cortico-medullären Segmente zu sezieren. Diese Segmente werden in zellulären Gerüst-freie Konstrukte bilden renale Organellen implantiert.
Abstract
Nieren-Transplantation ist jetzt ein Mainstream-Therapie bei terminaler Niereninsuffizienz. Mit rund 96.000 Menschen auf der Warteliste und nur ein Viertel dieser Patienten Transplantation zu erreichen, ist jedoch dringend nach Alternativen für diejenigen Organe versagen. Um die schädlichen Folgen der Dialyse zusammen mit der gesamten Gesundheitskosten zu verringern, die es verursacht, ist aktive Untersuchungen im Gange auf der Suche nach Alternativlösungen zur Organtransplantation. Implantierbare Tissue-Engineering renal zellulären Konstrukte sind ein solcher Machbaren Ansatz zu ersetzen verloren renal Funktionalität. Zum ersten Mal beschrieben, hier Mikrodissektion murinen Nieren zur Isolation von lebenden Corticomedullary renal Segmente. Diese Segmente sind in der Lage, rasche Einarbeitung in Gerüst-freie endothelial-Fibroblasten Konstrukte, die schnelle Verbindung mit Host Gefäßsystem einmal implantiert ermöglichen kann. Erwachsenen Maus Nieren wurden von Lebendspendern, gefolgt von Stereoskop Mikrodissektion, renale Segmente 200-300 µm im Durchmesser zu erhalten beschafft. Mehreren renal Konstrukte wurden hergestellt mit primären renal Segmente, die aus nur einer Niere geerntet. Diese Methode zeigt ein Verfahren, das renal Funktionsgewebe aus Organen zu retten könnte, die sonst weggeworfen würden.
Introduction
Chronische Niereninsuffizienz (CNI) gehört zu den aktuellen öffentlichen Gesundheitswesens Herausforderungen weltweit1. Die Prävalenz von CKD in den Vereinigten Staaten ist mehr als 14 % der Gesamtbevölkerung, mit mehr als 600.000 Amerikaner leiden an der schwersten Form, terminaler Niereninsuffizienz (ESRD)2. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit terminaler Niereninsuffizienz Dialyse und Nieren-Transplantation gehören. Obwohl etwa 25.000 Patienten Nierentransplantation jährlich unterziehen, sind eine beträchtliche Anzahl von Patienten hinzugefügt jährlich eine große Diskrepanz zwischen denen, die warten auf eine lebensrettende Organ und die empfangende Transplantation3. Neben seiner schwerwiegenden negativen Auswirkungen auf Langlebigkeit und Qualität des Lebens ist die Dialyse mit einer erstaunlichen finanziellen Belastung verbunden. Im Jahr 2014 betrug Medicare Ansprüche bezahlt mehr als $ 30 Milliarden für ESRD Patienten2. Mit einer begrenzten Orgel und keine offensichtlichen Abwärtstrend bei Patienten, die eine Dialyse Forschungsanstrengungen zur Ermittlung von Alternativlösungen zur Dialyse und Transplantation sind immer wichtig. Sogar eine relativ kurze Verzögerung bei der Notwendigkeit einer Dialyse erhöht ein Patient qualitätsbereinigten Lebensjahre und Produktivität erheblich während der Dialyse-bezogenen Kosten4,5,6zu verschieben.
Lösungen für funktionale Gewebeverlust, wie in terminaler Niereninsuffizienz, werden derzeit in Gewebe-Engineering und regenerativer Medizin Labore, mit unterschiedlichsten Ansätzen von Gerüst-basierte organoide Fertigung bis hin zu ganzen Organs engineering mit untersucht Organstrukturen für zelluläre Implantation7,8,9,10,11decellularized. Rekapitulation komplexe renale Strukturen aus marginalen oder ausrangierte Nieren ist nur teilweise untersucht worden. In der Tat sind fast 20 % der Nieren zur Transplantation beschafft für verschiedene Gründe12,13verworfen. Renal Funktionsgewebe aus diesen vermeintlichen Transplantate könnten genutzt und in einem oder mehreren Tissue Engineering Konstrukten integriert. Vorherige Studien belegen die Machbarkeit der Arbeit mit dieser ausrangierten Organe, Nieren für die extrazelluläre Matrix für Tissue engineering Zwecke14,15Nutzung. Jedoch haben nur wenige primäre nephronal Gewebe aus gesunden Nieren für Gewebe-Engineering Zwecke16,17,18verwendet.
Eine Methode, die zuvor von Kim Et Al. beschrieben bedeutet Isolation der renalen “Segmente” von gesunden Ratte Nieren, die dann auf Polyglycolic Acid (PGA) Gerüste für Konstrukt Herstellung16ausgesät wurden. Jedoch wenig Angaben über genaue Dissektion Methodik und Segmente stammen aus einer Kombination von fein hacken und Filtration. Wir beschreiben eine Änderung dieses Protokolls, die in ähnlicher Weise produziert diskrete renal Segmente mit intakten nephronal Architektur, sondern stützt sich auf Mikrodissektion Techniken. Nephrectomies erfolgen auf lebenden Erwachsenen Mäusen, nach denen die Nieren übertragen werden an die Dissektion Mikroskop, wo die renale Kapsel entfernt und das Gewebe weiter zergliedert. KK 30½ G Nadeln als schneidenden Instrumenten verwendet werden und auch als Beihilfe bei der Dissektion führt, als die Nadel Durchmesser ist gleich dem Ziel Durchmesser der renalen Segmente. Die Segmente isoliert, in diesem Fall murinen, renale Lebensfähigkeit in Kultur pflegen und mit Gerüst-freie endothelial-Fibroblasten zellulären Konstrukte19integrieren. Diese Konstrukte haben früher, andere Organe, darunter ein Bio-künstliche Bauchspeicheldrüse20zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renal lebendes Gewebe zu konstruieren, die Konstrukte in Bezug auf die Art von Zellen und Biomaterialien genutzt und in vielen Fällen sehr unterschiedlich verwendeten Methoden sind veraltet oder nicht gut charakterisierten in der Literatur-7. Während viele Stammzellen Ansätze verwenden oder Rekapitulation Einzelkomponenten der renalen Architektur isoliert, ist die Aussicht auf eine künstlich Neuerstellung eines ganzen Organs mit über 26 verschiedenen differenzierte Zelltypen aus zellulären S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH institutionelle Postdoc Ausbildung Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
