Recombinante colágeno péptido Microcarriers para la extensión celular y su posible uso como sistema de células en un biorreactor modelo
Summary
Proponemos un protocolo de expansión de la célula en microcarriers macroporoso y su uso como sistema de envío en un biorreactor de perfusión a una matriz de tejido decellularized de la semilla. También se incluyen diferentes técnicas para determinar la proliferación celular y la viabilidad de las células cultivadas en microcarriers. Además, demostramos la funcionalidad de las células después de culturas del biorreactor.
Abstract
Ingeniería de tejidos es un campo prometedor, centrado en el desarrollo de soluciones para la creciente demanda en los tejidos y órganos en relación con fines de trasplante. El proceso para generar dichos tejidos es complejo e incluye una adecuada combinación de tipos celulares específicos, andamios y estímulos físicos o bioquímicos para guiar la diferenciación y crecimiento celular. Microcarriers representan una atractiva herramienta para expandir las células en un microambiente (3D) tridimensional, ya que ofrecen mayor superficie para proporciones de volumen e imitar más de cerca la situación en vivo en comparación con los métodos tradicionales bidimensionales. El sistema vascular, suministrando oxígeno y nutrientes a las células y garantizar la eliminación de desechos, constituye un bloque de edificio importante al generar ingeniería de tejidos. De hecho, la mayoría de construcciones no después de ser implantado debido a carecer de apoyo vascular. En este estudio, presentamos un protocolo para la expansión de células endoteliales en microcarriers basados en colágeno recombinante bajo condiciones dinámicas en matraz de spinner y biorreactores, y explicamos cómo determinar viabilidad celular de configuración y funcionalidad. Además, proponemos un método para la entrega de células para propósitos de vascularización sin medidas de separación adicional necesarios. Además, ofrecemos una estrategia para evaluar la vascularización de la célula potenciales en un biorreactor de perfusión en una matriz biológica decellularized. Creemos que el uso de los métodos presentados podría conducir al desarrollo de nuevas terapias basadas en células para una amplia gama de usos en la práctica clínica de la ingeniería del tejido.
Introduction
Un problema general en aplicaciones de ingeniería de tejidos es rendir una masa celular alta con el fenotipo de diferenciación correcto en la situación de necesidad. La aplicación de microcarriers para abordar este tema comenzó en 1967 con el aumento de importancia hasta la fecha en campos tales como ingeniería de tejidos Ortopedia para generación a gran escala de piel, hueso, cartílago y tendones1. Permiten el manejo de cultivos adherentes de manera similar a la de suspensión culturas2 mediante la expansión de células en sustratos de (3D) tridimensionales de microescala. Tal modo células experimentan una fuente homogénea de nutrientes y las interacciones célula-matriz que conducen a un mejor mantenimiento en vivo3,4 diferenciación que a menudo se pierde en el tiempo en 2D acerca a5. Una mayor relación superficie a volumen – eventualmente conduce a rendimientos6,7más alto de la célula, más gas y nutrientes los tipos de cambio en comparación con sistemas estáticos8, la posibilidad de regular y someter la cultura a la física estímulos9y el potencial para la intensificación de los procesos de expansión7 son ventajas. Varias características como el diámetro, densidad, porosidad, carga superficial y adherencia propiedades10,11 distinguen los diferentes disponibles en el mercado micro – y macro-portadores. Sin embargo, una de las principales ventajas es su potencial microtissues entrega a demanda o defecto del sitio.
Para las aplicaciones de la tecnología de potencia en ingeniería del tejido fino del hueso, nos ilustra en un anterior informe12 la producción de una nueva potencia tipo constituido por un colágeno recombinante péptido (RCP, comercialmente disponible como Cellnest). Esta nueva potencia permite el GMP obediente a escala de la producción de andamio y de la célula, según sea necesario para la entrega de la célula en un escenario clínico. En este contexto, ajuste de estabilidad del andamio, tasa de degradación y propiedades superficiales a través de la elección adecuada de una estrategia de reticulación adecuado permite adaptar la técnica para la aplicación seleccionada, tipo de interés de la célula o tejido13de destino. En particular, el empleo potencial de esta potencia como un sistema celular inyectable para uso terapéutico14 hace particularmente interesante en un ajuste clínico.
En este trabajo, por lo tanto, ilustramos el procedimiento de cultivo para el aislamiento y la expansión de la médula ósea mesenquimales estromales células humanas (hBMSCs) y dérmicas microvasculares células endoteliales humanas (HDMECs) en recombinante colágeno basado en péptido-basada microcarriers y su preparación para el parto en un ajuste clínico. Además, describimos protocolos adicionales útiles para el mantenimiento de la viabilidad celular en implantación.
Viabilidad celular después de la implantación de hecho es fuertemente dependiente de vascularización15,16,17, que garantiza el intercambio de oxígeno y nutrientes y facilita la eliminación de desechos. Biorreactores constituyen un método para superar los desafíos de la vascularización en la ingeniería de tejidos y mantener la viabilidad de las células, mediante perfusión de tal modo proporcionando oxígeno y nutrientes18de medio de cultivo. Aquí, nos ilustran un método en vitro para evaluar la capacidad de migración de las células endoteliales microvasculares de la RCP microcarriers un biomatrix y su capacidad para contribuir a la vascularización de novo y la angiogénesis. Este biomatrix es un segmento decellularized del yeyuno porcina denominado BioVaSc (biológica andamio vascularizado), rica en colágeno y elastina y con conserva estructuras vasculares, que incluye una alimentación de la arteria y una vena drenaje19 que ha sido aplica para problemas de implantación20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un objetivo de potencia es la expansión de las células manteniendo su diferenciación con el fin de entregar las células al lugar de necesidad. El método mentionado aquí introducir microcarriers RCP donde las células fueron capaces de colocar, proliferan y colonizan el microcarriers con alta densidad celular. Esto fue observado por vivir muertas o coloración, en la cual más del 90% de células viables fueron detectado mientras que sólo algunas células muertas fueron obtenidas después de 7 días de culturas din…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea séptimo marco programa FP7/2007-2013 bajo el acuerdo de donación n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens de fabricación de Fujifilm Europe B.V., la asistencia técnica durante la RCP fabricación y Werner Stracke del Instituto Fraunhofer para ISC de la investigación del silicato, para obtener ayuda con el análisis de SEM.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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