Collagène recombinant j’ai microporteurs de Peptide pour l’Expansion des cellules et leur utilisation potentielle comme système de diffusion de cellule dans un bioréacteur modèle
Summary
Nous vous proposons un protocole d’expansion cellulaire sur Microsupports macroporeux et leur utilisation comme système de livraison dans un bioréacteur de perfusion pour amorcer une matrice de tissu DECELLULARISE. Nous incluons également différentes techniques pour déterminer la prolifération cellulaire et la viabilité des cellules cultivées sur Microsupports. En outre, nous démontrons la fonctionnalité des cellules après cultures bioréacteur.
Abstract
Génie tissulaire est un domaine prometteur, axé sur le développement de solutions pour la demande croissante sur les tissus et les organes au sujet des fins de transplantation. Le processus pour générer ces tissus est complex et comprend une combinaison appropriée de types spécifiques de cellules, échafaudages et des stimuli physiques ou biochimiques pour guider la croissance cellulaire et la différenciation. Microsupports représentent un outil attrayant pour étendre des cellules dans un micro-environnement (3D) en trois dimensions, puisqu’ils offrent plus de surface-à ratios volume et imitent plus étroitement la situation in vivo par rapport aux méthodes traditionnelles de deux dimensions. Le système vasculaire, fournissant l’oxygène et des nutriments vers les cellules et assurer l’enlèvement des déchets, constitue une composante importante lorsque génération conçu des tissus. En fait, la plupart des constructions échouent après être implanté en raison de manque de soutien vasculaire. Dans cette étude, nous présentons un protocole pour l’expansion des cellules endothéliales sur microporteurs d’à base de collagène recombinant dans des conditions dynamiques en fiole de spinner et bioréacteurs et nous expliquer comment déterminer dans cette viabilité cellulaire de réglage et de fonctionnalité. En outre, nous proposons une méthode pour la livraison de cellules à des fins de vascularisation sans étapes de détachement supplémentaires nécessaires. En outre, nous fournissons une stratégie pour évaluer la vascularisation de cellule potentielle dans un bioréacteur de perfusion sur une matrice biologique DECELLULARISE. Nous croyons que l’utilisation des méthodes présentées pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies cellulaires pour une vaste gamme d’applications dans la pratique clinique en génie tissulaire.
Introduction
Un problème général dans les applications d’ingénierie tissulaire est pour donner une masse cellulaire élevée avec le phénotype de différentiation correcte à l’endroit du besoin. L’application des microporteurs pour régler ce problème a commencé en 1967 avec l’augmentation de l’importance à ce jour dans des domaines tels que l’ingénierie des tissus orthopédiques pour la production à grande échelle de la peau, des os, cartilages et tendons1. Ils permettent la manipulation des cultures adhérentes de façon semblable à celle des cultures de suspension2 par l’expansion des cellules sur des substrats (3D) en trois dimensions de micro-échelle. Ainsi les cellules expérience un apport nutritif homogène et interactions cellule-matrice que conduisent à mieux entretenir en vivodifférenciation4 3,, qui est souvent perdue au fil du temps en 2D s’approche de5. Un ratio plus élevé de la surface-volume – aboutissant à des cellules plus haut rendements6,7, plus de gaz et les taux de change des éléments nutritifs en comparant des systèmes statiques8, la possibilité de réglementer et de soumettre la culture physique des stimuli9et le potentiel d’intensification du processus expansion7 sont a d’autres avantages. Plusieurs caractéristiques comme diamètre, densité, porosité, charge superficielle et adhérence propriétés10,11 distinguent les différentes disponibles dans le commerce micro – et macro-transporteurs. Cependant, un des principaux avantages est leurs vecteurs potentiels comme microtissues, à défaut de site ou de la demande.
Pour les applications de la technologie avec des microporteurs en ingénierie tissulaire osseuse, nous a indiqué dans un précédent rapport12 la production d’un nouveau avec des microporteurs type constitué d’un collagène recombinant j’ai peptide (RCP, disponible dans le commerce comme Cellnest). Cette nouvelle avec des microporteurs permet la GMP compatible vers le haut de l’échelle de la production d’échafaudage et cellule, selon les besoins pour la livraison de cellule dans un scénario clinique. Dans ce contexte, réglage de la stabilité de l’échafaudage, le taux de dégradation et des propriétés de surface par le biais de choix d’une stratégie adaptée de réticulation permet d’adapter la technique à l’application sélectionnée, type d’intérêt de cellule ou cibler des tissus13. En particulier, l’emploi éventuel de ce avec des microporteurs comme un système de diffusion de cellule injectable pour application thérapeutique14 les rend particulièrement intéressants en milieu clinique.
Dans cet article, nous illustrons donc la procédure de culture pour l’isolement et l’expansion humaines moelle osseuse stromales cellules mésenchymateuses (hBMSCs) et humains par voie cutanée cellules endothéliales microvasculaires (HDMECs) sur je-base de collagène recombinant microsupports peptidique et leur préparation pour la livraison en milieu clinique. En outre, nous décrivons les protocoles additionnels utiles pour le maintien de la viabilité des cellules lors de l’implantation.
La viabilité cellulaire après l’implantation est en effet dépend fortement de la vascularisation15,16,17, qui assure l’échange d’oxygène et de nutriments et facilite l’élimination des déchets. Bioréacteurs constituent une approche pour relever les défis de la vascularisation en génie tissulaire et maintenir la viabilité des cellules, par le biais de la perfusion du milieu de culture, fournissant ainsi de l’oxygène et des nutriments18. Ici, nous montrons une méthode in vitro pour évaluer la capacité de migration des cellules endothéliales microvasculaires de la RCP microporteurs un biomatrix et leur capacité à contribuer à la vascularisation de novo et l’angiogenèse. Cette biomatrix est un segment DECELLULARISE de jéjunum de porc appelé BioVaSc (biologique vascularisé échafaudage), riche en collagène et d’élastine et avec préservé les structures vasculaires, qui comprend une alimentation artère et veine drainant19 qui a été appliqué pour l’implantation des questions20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un des buts principaux d’avec des microporteurs sont l’expansion des cellules tout en conservant leur différenciation afin de livrer des cellules au lieu de nécessité. La méthode représentée introduire des microporteurs RCP où les cellules ont pu fixer, prolifèrent et coloniser les microporteurs avec haute densité cellulaire. Cela a été observé par live/dead coloration, dans lequel plus de 90 % des cellules viables ont été détectés alors que seulement quelques cellules mortes ont été obtenus après …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de l’Union européenne septième cadre Programme FP7/2007-2013 au titre de la subvention contrat n ° 607051 (BIO-inspirer). Nous remercions Carolien van Spreuwel-Goossens de Fujifilm fabrication Europe B.V., de l’assistance technique pendant la fabrication de RCP et Werner Stracke Fraunhofer Institute pour l’ISC de Silicate de recherche, d’aide à l’analyse de la SEM.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
