Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello
Summary
Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l’attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.
Abstract
Ingegneria tissutale è un settore promettente, focalizzato sullo sviluppo di soluzioni per la crescente domanda su tessuti e organi in relazione alle finalità di trapianto. Il processo per generare tali tessuti è complesso e comprende un’appropriata combinazione di tipi cellulari specifici, impalcature e stimoli fisici o biochimici per guidare la crescita delle cellule e differenziazione. Microcarriers rappresentano uno strumento attraente per espandere le cellule in un microambiente tridimensionale (3D), poiché forniscono maggiore superficie–rapporti di volume e imitare più da vicino la situazione in vivo rispetto ai metodi tradizionali bidimensionali. Il sistema vascolare, approvvigionamento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e per garantire la rimozione dei rifiuti, costituisce un elemento importante quando generazione progettato tessuti. Infatti, maggior parte dei costrutti non riuscire dopo essere impiantati a causa della mancanza di supporto vascolare. In questo studio, presentiamo un protocollo per l’espansione delle cellule endoteliali su microcarriers basati su collagene ricombinante in condizioni dinamiche in boccetta spinner e bioreattori e spieghiamo come determinare in questa vitalità cellulare impostazione e funzionalità. Inoltre, proponiamo un metodo per la consegna delle cellule per scopi di vascolarizzazione senza passaggi aggiuntivi distacco necessari. Inoltre, mettiamo a disposizione una strategia per valutare la vascolarizzazione delle cellule potenziale in un bioreattore di aspersione su una matrice biologica decellularizzato. Noi crediamo che l’uso dei metodi presentati potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie basate sulle cellule per una vasta gamma di applicazioni nella pratica clinica di ingegneria tissutale.
Introduction
Un problema generale in applicazioni di ingegneria del tessuto è di produrre una massa elevata delle cellule con il fenotipo di differenziazione corretta nella posizione di bisogno. L’applicazione di microcarriers per affrontare questo problema iniziato nel 1967 con sempre maggiore importanza fino ad oggi nei campi come ingegneria tissutale ortopedici per generazione su larga scala di pelle, ossa, cartilagine e tendini1. Essi consentono la movimentazione di culture aderente in modo simile a quello di sospensione culture2 espandendo cellule su substrati di Microscala tridimensionale (3D). Quindi le cellule esperienza un apporto nutritivo omogeneo e interazioni cellula-matrice che piombo per migliore manutenzione di in vivodifferenziazione4 3,, che è spesso persa nel tempo in 2D si avvicina a5. Un più alto rapporto superficie-volume – finalmente che conduce alla cella superiore rendimenti6,7, superiore di gas e nutrienti tassi di cambio rispetto a sistemi statici8, la possibilità di regolare e salvi la cultura fisica stimoli9e il potenziale per la scalabilità del processo espansione7 sono ulteriori vantaggi. Diverse funzionalità come diametro, densità, porosità, carica superficiale e adesione proprietà10,11 distinguere il commercialmente disponibili micro – e macro-elementi portanti differenti. Tuttavia, uno del vantaggio principale è la loro consegna potenziale come microtissues sito difetto o domanda.
Per le applicazioni della tecnologia microcarrier in ingegneria del tessuto osseo, abbiamo illustrato in un precedente rapporto12 la produzione di un nuovo microcarrier tipo costituita di un collagene ricombinante I peptidi (RCP, disponibile nel commercio come Cellnest). Questo nuovo microcarrier permette il secondo GMP le proporzioni di impalcatura e cella di produzione, come necessario per la consegna delle cellule in uno scenario clinico. In questo contesto, ottimizzazione della stabilità dell’impalcatura, tasso di degradazione e proprietà di superficie attraverso la corretta scelta di una strategia di reticolazione adatta permette di adattare la tecnica per l’applicazione selezionata, cell tipo di interesse o tessuto13di destinazione. In particolare, l’occupazione potenziale di questa microcarrier come un sistema di consegna delle cellule iniettabili per applicazione terapeutica14 li rende particolarmente interessanti in una regolazione clinica.
In questa carta, abbiamo quindi illustrare la procedura di coltura per l’isolamento e l’espansione delle derivate da midollo osseo cellule mesenchimali umane stromali (hBMSCs) e cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HDMECs) il collagene-io-base ricombinante microcarriers peptidici e la loro preparazione per la consegna in una regolazione clinica. Inoltre, descriviamo protocolli aggiuntivi utili per il mantenimento della vitalità cellulare al momento dell’impianto.
La vitalità cellulare dopo l’impianto è infatti fortemente dipendente vascolarizzazione15,16,17, che assicura uno scambio di ossigeno e nutrienti e facilita la rimozione dei rifiuti. Bioreattori costituiscono un approccio per superare le sfide di vascolarizzazione in ingegneria tissutale e mantenere la vitalità cellulare, tramite aspersione del terreno di coltura fornendo quindi ossigeno e sostanze nutritive18. Qui, vi illustriamo un metodo in vitro per valutare la capacità di migrazione delle cellule endoteliali microvascolari da microcarriers la RCP per una biomatrice e la loro capacità di contribuire alla vascolarizzazione de novo e l’angiogenesi. Questo biomatrice è un segmento decellularizzato del digiuno porcina definito BioVaSc (Scaffold biologici vascolarizzato), ricca di collagene ed elastina e con conservato le strutture vascolari, che comprende un’arteria d’alimentazione e una vena drenante19 che è stato applicato per l’impianto problemi20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno degli obiettivi principale di microcarrier è l’espansione di cellule pur mantenendo la loro differenziazione al fine di fornire le cellule al posto del bisogno. Il metodo rappresentato introdurre RCP microcarriers dove le cellule erano in grado di allegare, proliferare e colonizzare il microcarriers con densità elevata delle cellule. Ciò è stata osservata da live/dead colorazione, in cui oltre il 90% delle cellule vitali sono stati rilevati mentre solo poche cellule morte sono state ottenute dopo 7 giorni di cult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall’Unione europea settimo quadro programma FP7/2007-2013 sotto accordo di finanziamento n ° 607051 (BIO-ispirare). Ringraziamo Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm Manufacturing Europe B.V., per l’assistenza tecnica durante la produzione di RCP e Werner Stracke dall’Istituto Fraunhofer per silicato ricerca ISC, per assistenza con l’analisi di SEM.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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