組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。
Summary
多孔体 microcarriers のセル拡張プロトコル 310 マトリックスをシードする灌流型バイオリアクターにおける情報配信システムとしての利用を提案しています。我々 は、細胞の増殖と microcarriers 上で培養した細胞の生存率を決定するさまざまなテクニックがあります。さらに、バイオリアクター培養後の細胞の機能を示します。
Abstract
ティッシュ ・ エンジニア リングは、組織や臓器移植の目的についての需要の増加のためのソリューションを開発に焦点を当てて、有望な分野です。このような組織を生成するプロセスは複雑であり、特定の細胞型、足場、および身体的または生化学的刺激細胞の成長と分化を導くための適切な組み合わせが含まれています。Microcarriers は、以来、彼らはより高い表面に体積比を提供し、二次元の伝統的な方法と比較して体内の状況をもっと密接に模倣、三次元 (3 D) の微小環境のセルを展開する魅力的なツールを表します。組織設計を生成するとき、血管、細胞に酸素と栄養を供給し、廃棄物の除去は重要なビルディング ブロックを構成します。実際には、ほとんどの構成体は血管サポートの欠乏のために注入されて失敗します。本研究ではスピナー フラスコ、バイオリアクター、動的条件の下で遺伝子組換えコラーゲン ベース microcarriers の内皮細胞の拡張のためのプロトコルを提案する、この設定セル実行可能性と機能を決定する方法について述べる。さらに、血管新生目的で必要な追加の取り外し手順携帯配信のための方法を提案する.さらに、我々 は decellularized 生物学的マトリックスの灌流型バイオリアクターの潜在的な細胞血管新生を評価するための戦略を提供します。提示方法の使用は、組織工学実習におけるアプリケーションの大規模な範囲の新しい細胞を用いた治療法の開発につながることを考えています。
Introduction
組織エンジニア リング アプリケーションで一般的な問題の 1 つはの場所で正しい分化型高細胞塊を生成する必要があります。この問題に対処するため microcarriers のアプリケーションは、これまで大規模な世代の皮膚、骨、軟骨、腱1整形外科組織工学などの分野で重要性を増して、1967 年に開始。彼らを許可する付着性文化の取り扱い方法でサスペンション文化2のようなマイクロ三次元 (3 D) 基板上への細胞の拡大によって。それにより細胞は均質な栄養供給や3,4分化はしばしば失われる 2 D で時間をかけて生体内でのより良いメンテナンスにつながる5に接近する細胞マトリックスの相互作用を経験します。最終的に高いセルの利回り6、7、高いガスにつながる – より高い表面-容積比と静的なシステムに8、規制、物理的な文化を対象とする可能性を比較する栄養の為替レート刺激9、および拡張のプロセス7のスケール アップの可能性はさらに利点が。直径、密度、間隙率、表面電荷接着特性10,11などいくつかの機能は、異なる市販マイクロおよびマクロ-キャリアを区別します。しかし、主な利点の 1 つはサイトの欠陥または需要への放射能として潜在的な彼らの配信です。
生産の前レポート12に示す我々 の骨の組織工学におけるマイクロ ・ キャリア技術の応用、新しいマイクロ ・ キャリアの種類を構成した組換えコラーゲンの私ペプチド (RCP、Cellnest として市販)。この新しいマイクロ ・ キャリアは、携帯配信シナリオでは臨床に必要な足場とセル生産のスケール アップ GMP に準拠したことができます。このコンテキストで足場の安定性、劣化率と最適架橋戦略の適切な選択により表面特性のチューニング選択したアプリケーション技術を適応、金利の種類を細胞または組織13をターゲットすることができます。特に、治療上の適用14注射携帯配信システムとしてこのマイクロ ・ キャリアの潜在的な雇用は、それら臨床設定で特に興味深い。
本稿で我々 したがって分離とひと骨髄由来間葉系間質細胞 (hBMSCs) のひと皮膚微小血管内皮細胞 (HDMECs) コラーゲン私、基づく組換えに拡大培養例を示しますペプチド ベースの microcarriers、臨床の現場での配信のための準備。さらに、注入時に細胞生存率の維持に役立つ追加のプロトコルについて述べる。
移植後の細胞生存率は実際に血管新生15,16,17酸素と栄養の交換を保証し、廃棄物の除去を容易に強く依存します。バイオリアクターは、再生組織工学における血管新生課題を克服し、細胞生存率、それにより酸素や栄養素の18を提供する培養液の灌流を維持する方法の 1 つを構成します。ここでは、我々 は、マトリックス、 de novoの血管新生と血管新生に貢献する能力を RCP microcarriers から微小血管内皮細胞の移行機能を評価するための in vitro法を示しています。このマトリックスは、ブタの腸の decellularized セグメント BioVaSc (生物学的血管柄付き足場) 豊富なコラーゲンとエラスチンと呼ばれると栄養動脈が含まれています血管構造とされている流出静脈19を保存着床の問題20の適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロ ・ キャリアの 1 つの主な目的は、必要な場所にセルを提供するために、分化を維持しながら細胞の拡大です。表されたメソッドは、セルを添付し、増殖、細胞密度の高いと、microcarriers を植民地化しできた RCP microcarriers をご紹介します。これはライブ/デッド染色、生菌の 90% 以上が動的文化の 7 日後のみいくつかの死んだ細胞が得られた中に検出されたで観測されました。同様に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの結果につながる研究資金から、欧州連合第 7 フレームワーク プログラム FP7/2007-2013 付与契約 n ° 607051 の下で (バイオ刺激) を受けています。私たちは、SEM 分析支援のためケイ酸塩研究 ISC の RCP 製造とフラウンホーファー研究所からヴェルナー ・ ストラックの間に技術援助から富士フイルム製造ヨーロッパ BV、キャロライン ・ ヴァン ・ Spreuwel Goossens を感謝します。
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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