재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델
Summary
우리는 macroporous microcarriers에 셀 확장 프로토콜 및 decellularized 조직 매트릭스를 시드하 관류 생물에서 배달 시스템으로 그들의 사용을 제안 합니다. 우리는 또한 세포 증식 및 microcarriers에 경작 하는 세포의 생존 능력을 결정 하기 위해 다른 기술을 포함 합니다. 또한, 생물 반응 기 배양 후 세포의 기능을 설명합니다.
Abstract
조직 공학 유망 분야, 조직 및 장기 이식 목적에 대 한 수요 증가 대 한 솔루션 개발에 초점을 맞춘입니다. 같은 조직을 생성 하는 과정 복잡, 고 특정 세포 유형, 건설 기계, 및 세포 성장 및 분화를 안내를 물리적 또는 생 화 확 적인 자극의 적절 한 조합을 포함 한다. Microcarriers 셀에 3 차원 (3D) microenvironment, 이후 그들은 더 높은 표면에 볼륨 비율을 제공 하 고 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 방법에 비해 vivo에서 상황을 모방 확장 하는 매력적인 도구를 나타냅니다. 혈관 시스템, 세포에 산소와 양분을 공급 하 고 폐기물 제거, 조직 설계를 생성 하는 때 중요 한 빌딩 블록을 구성 합니다. 사실, 대부분 구조 혈관 지원 부족 인해 이식 되 고 후 실패 합니다. 이 연구에서 우리 스피너 플라스 크 및 생물 반응 기, 동적 조건 하에서 재조합 형 콜라겐 기반 microcarriers에 내 피 세포 확장에 대 한 프로토콜을 제시 하 고이 설정 세포 생존 능력 및 기능을 결정 하는 방법을 설명. 또한, 우리는 필요한 추가 분리 단계 없이 vascularization 목적 셀 배달 하는 방법을 제안합니다. 또한, 우리 decellularized 생물 매트릭스에 관류 생물에 잠재적인 셀 vascularization를 평가 하는 전략을 제공 합니다. 제시 방법의 사용 조직 엔지니어링 임상 연습에서 응용 프로그램의 큰 범위에 대 한 새로운 세포 기반 치료법의 발전으로 이어질 수 믿습니다.
Introduction
조직 공학 응용 프로그램에 하나의 일반적인 문제는 수익률 높은 세포 질량의 위치에서 올바른 차별화 표현 형을 필요. 이 문제를 해결 하려면 microcarriers의 응용 프로그램은 피부, 뼈, 연골, 힘 줄1의 대규모 세대에 대 한 정형 외과 조직 공학 분야에서 최신의 증가 함께 1967 년에 시작 했다. 그들은 허용 부착 문화의 처리 방법으로 현 탁 액 문화2 와 비슷한 미 3 차원 (3D) 기판에 셀을 확장 하 여. 그로 인하여 세포 균질 영양소 공급 및 세포-매트릭스 상호 작용 vivo에서3,4 차별화의 차원에서 시간이 지남에 따라 자주 분실 되는 더 나은 유지 보수를 리드5접근 경험. 결국 높은 수익률6,7셀, 높은 가스 이어지는 높은 표면 볼륨 비율-고 영양 환율 정적 시스템8, 규제 하 고 물리적 문화 주제 가능성에 비교 자극9, 그리고 잠재적인 확장 과정7 확장 추가 이점이 있습니다. 직경, 밀도, 다공성, 표면, 그리고 접착 속성10,11 등 여러 가지 기능이 다른 상용 마이크로-와 매크로-사업자 구분. 그러나, 주요 장점 중 하나는 그들의 microtissues로 잠재적인 사이트 결함 또는 배달 수요입니다.
Microcarrier 기술 뼈 조직 공학에서의 응용 프로그램에 대 한 우리에 나와 있는 이전 보고서12 생산의 새로운 microcarrier 유형 구성 재조합 콜라겐의 나 펩 티 드 (RCP, Cellnest으로 상용). 임상 시나리오에 셀 납품을 위한 필요에 따라이 새로운 microcarrier는 GMP 준수 최대 비 계 및 셀 생산의 스케일링 수 있습니다. 이러한 맥락에서 비 계 안정성, 속도 저하, 및 적합 한 가교 전략의 적절 한 선택을 통해 표면 특성의 조정 선택 된 응용 프로그램에 기술을 적응, 관심 유형의 세포 또는 조직13을 대상 수 있습니다. 특히, 치료 응용 프로그램14 주 사용 셀 배달 시스템으로이 microcarrier의 잠재적인 고용 그들은 게 임상 설정에서 특히 흥미로운.
이 문서에서 우리는 따라서 분리와 인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)와 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HDMECs) 콜라겐-난-기반 재조합에의 확장에 대 한 자란 절차 설명 펩타이드 기반 microcarriers, 그리고 임상 설정에서 납품을 위한 그들의 준비. 또한, 우리는 주입 시 세포 생존 능력의 유지 보수에 대 한 유용한 추가 프로토콜을 설명합니다.
이식 후 세포 생존 능력은 사실 vascularization15,,1617, 산소와 영양분의 교환을 보장 하 고 폐기물 제거를 용이 하 게에 강하게 의존 합니다. Bioreactors는 vascularization 극복해 조직 공학에서 그로 인하여 산소와 영양분18제공 하는 문화 매체의 관류를 통해 세포 생존 능력을 유지 하는 한 가지 방법은 구성 합니다. 여기, 우리는 biomatrix 하 데 노 보 vascularization와 신생 수 그들의 RCP microcarriers에서 microvascular 내 피 세포의 마이그레이션 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 메서드를 보여 줍니다. 이 biomatrix 이며 돼지 공장 decellularized 세그먼트 되 나 BioVaSc (생물 나가도록 비 계), 콜라겐과 엘라 스 틴에 풍부한 혈관 구조, 먹이 동맥을 포함 하 고는 배수 정 맥19 보존 이식 문제20적용.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microcarrier의 하나의 주요 목표는 필요의 위치로 셀을 전달 하기 위하여 그들의 차별화를 유지 하면서 세포의 확장입니다. 표현된 방법 소개 RCP microcarriers 세포 부착, 증식, 및 높은 세포 밀도 microcarriers 식민지를 수 있었다. 이 라이브/죽은 얼룩, 어떤 실행 가능한 세포의 90% 이상 검색만 몇 죽은 세포의 동적 문화 7 일 후 가져온 동안에 의해 관찰 되었다. 마찬가지로, SEM 이미지 셀 문화의 7 일 후에 m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 결과 연구 자금에서 유럽 연합 7 번째 프레임 워크 프로그램 FP7/2007-2013 부여 계약 n ° 607051에서 (바이오 영감)을 받고 있다. SEM 분석에 대해 규 산 연구 ISC를 위한 RCP 제조, 프라 운 호퍼 연구소에서 베르너 Stracke 동안 기술 지원에 감사 반 Carolien Spreuwel-후 지 필름 제조 유럽 변환기에서 Goossens 하 고.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
